MHC-肽四聚體技術在CTL表位鑒定中的應用.pdf

1、MHC-肽四聚體(Peptide-MHC tetramer)技術是免疫學和臨床診斷中重要的技術，廣泛應用于免疫學研究及免疫性疾病臨床研究。研究證實，T細胞是通過TCR識別靶細胞或抗原遞呈細胞表面MHC分子結合的特異性表位肽復合體，但這種特異性識別親和力低，迅速發(fā)生解離。MHC-肽四聚體復合物的原理是通過增強T細胞受體與MHC-肽復合物親和力，達到可直接特異性檢測T細胞的目的。該法的優(yōu)勢在于迅速、直接、靈敏且特異性強，但也存在復性率低、步

2、驟繁瑣等缺點。雖然研究者對MHC-肽四聚體的制備技術做了很多改進，但仍未很好地解決這些問題。 MHC-I分子限制性的CTL表位鑒定一直是免疫學的熱點，是基于表位進行免疫診斷、免疫治療、疫苗開發(fā)的關鍵。傳統(tǒng)的CTL表位鑒定方法主要采用先合成大量的交疊肽，再通過后續(xù)淋巴細胞實驗進行選取，存在費時、費力、費用大、鑒定效率低等缺點。有研究者用TAP(Transporters associated with antigen proces

3、sing)缺陷細胞T2細胞，采用肽親和力實驗進行表位鑒定，取得了很好的結果，但繁瑣的標記、染色及反復洗滌細胞過程可能對細胞造成的損傷是限制該方法廣泛應用的主要原因。 眾所周知，DsRed和ZsGreen均表達為四聚體結構的熒光蛋白，所以，我們設想將MHC-I分子和ZsGreen在真核細胞中融合表達，直接獲取MHC-四聚體，簡化傳統(tǒng)制備MHC-四聚體中繁瑣的原核表達、折疊、生物素化、熒光標記等過程，且構建的MHC-四聚體理論上可加

4、載任意感興趣的抗原肽，使檢測更加靈活。而運用此原理將β2M和ZsGreen融合表達獲得β2M四聚體，該融合蛋白理論上可以和MHC-I、特異性表位肽結合形成MHC-肽四聚體。利用此原理，將此融合蛋白應用于肽親和力實驗，可能極大地改進CTL表位鑒定方法。 目的： 本研究試圖運用分子克隆技術、真核表達、鎳親和層析法純化等方法直接獲得MHC-四聚體，優(yōu)化MHC-肽四聚體制備技術，并將該技術運用于MHC-肽親和力實驗，改進CTL表

5、位鑒定方法。 方法： 1．通過PCR技術得到小鼠MHC-I分子的可溶性部分sKb的DNA序列，并運用分子克隆技術將這段DNA片段與4×GGGS-ZsGreen-6×His載入包裝質粒FUGW的載體中，構建sKb-GGGS-ZsGreen-6×His標簽的融合蛋白真核表達質粒FUsKbZsGreenGGGS； 2．運用細胞轉染技術，將FUsKbZsGreenGGGS轉染293FT細胞，融合表達sKbZsGreenG

6、GGS； 3．裂解表達sKbZsGreenGGGS的293FT細胞，利用融合蛋白所帶的6×His標簽，鎳親和層析法純化sKbZsGreenGGGS，并脫鹽、濃縮； 4．將sKbZsGreenGGGS和β2M、OVA肽組裝后得到MHC-OVA肽四聚體，該四聚體與B3Z細胞反應，流式細胞術檢測； 5．通過PCR技術得到人β2M分子的DNA序列，并運用分子克隆技術將這段DNA片段與4×GGGS-ZsGreen-6×Hi

7、s載入包裝質粒FUGW的載體中，構建β2M-GGGS-ZsGreen-6×His標簽的融合蛋白真核表達質粒FUβ2MZsGreenGGGS； 6．運用細胞轉染技術，將FUβ2MZsGreenGGGS轉染293FT細胞，將β2M-GGGS-ZsGreen-6×His片段嵌入293FT細胞基因組DNA，融合表達β2MZsGreenGGGS； 7．裂解表達β2MZsGreenGGGS的293FT細胞，利用融合蛋白所帶的6×Hi

8、s標簽，鎳親和層析法純化β2MZsGreenGGGS，并脫鹽、濃縮； 8．將β2MZsGreenGGGS和表位肽共同與TAP缺陷細胞T2細胞反應，通過流式細胞術檢測T2細胞標記綠色熒光的情況鑒定表位，并與傳統(tǒng)肽親和力實驗對比。 機制探討： 1．MHC-肽四聚體技術的優(yōu)化 通過將MHC-I分子和ZsGreen融合表達，直接構建帶綠色熒光的MHC-I四聚體，將該四聚體與特異性表位肽結合后與特異性雜交瘤細胞反應

9、，流式細胞檢測，通過細胞染色比例證實所構建的MHC-I四聚體復合物可被特異性T細胞識別、結合，對MHC-肽四聚體復合物技術的優(yōu)化的方法可行。本部分研究利用真核表達、蛋白質純化技術獲得MHC-I四聚體，與特異性表位肽及特異性T細胞反應后流式細胞術證實該四聚體具有與特異性表位肽結合并被特異性T細胞識別的能力。 2．MHC-肽四聚體技術在表位鑒定中的應用 將β2M和ZsGreen融合表達，獲得帶綠色熒光蛋白的β2M四聚體，將該

10、四聚體與不同的表位肽、T2細胞反應，流式細胞檢測，根據(jù)T2細胞染色情況鑒定抗原表位。本部分實驗運用T2細胞株TAP(Transporters associated with antigen processing)缺陷的特點及β2M促進MHC I類分子與抗原表位肽結合的作用，將β2M四聚體、表位肽及T2細胞反應，陽性肽與β2M四聚體、T2細胞表面少量MHC-1分子結合形成穩(wěn)定的帶綠色熒光的MHC-肽四聚體復合物，同時在T2細胞表面標記綠色

11、熒光，通過流式細胞術即可鑒定表位。 結論： 1．構建了1種MHC-I四聚體的真核表達質粒FUsKbZsGreenGGGS并表達、純化得到sKbZsGreenGGGS，將sKbZsGreenGGGS和β2M、OVA肽組裝后被B3Z細胞識別、結合，流式細胞檢測； 2．構建了β2M-四聚體的真核表達質粒FUβ2MZsGreenGGGS并表達、純化得到β2MZsGreenGGGS，將β2MZsGreenGGGS與表位肽共