抗凋亡蛋白Mcl-1及Siah-1S在細胞凋亡中的作用機制研究.pdf

1、Mcl-1作為抗凋亡Bcl-2家族蛋白成員之一，可以阻斷多種凋亡誘導劑所誘導的細胞凋亡，然而Mcl-1抑制細胞凋亡的分子機制并沒有被完全地弄清楚。 在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Mcl-1可以和促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma相互作用，它們之間的相互作用分別由Mcl-1的BH1結構域和Puma的BH3結構域介導。免疫熒光結果顯示Mcl-1和Puma可以共定位于線粒體，暗示Mcl-1和Puma之間的結合是發(fā)生在線粒體上的。進一步的研究結

2、果表明Mcl-1．可以抑制Puma誘導的細胞凋亡，而且Mcl-1的BH1結構域對于其抗Puma誘導的細胞凋亡起著重要的作用。有意思的是，Mcl-1的蛋白穩(wěn)定性可以被Puma提高，而且這種Mcl-1蛋白穩(wěn)定性的提高是由于和Puma的直接結合而引起的，因為將Puma的BH3結構域去除之后，Puma就不再能提高Mcl-1的蛋白穩(wěn)定性，我們同時也證明了Puma結合Mcl-1只能部分而不能完全地阻止Mcl-1的快速降解。最后我們發(fā)現(xiàn)除了PEST和

3、BH1結構域介導Mcl-1的快速降解之外，還存在其它的降解信號，而且位于Mcl-1蛋白的C末端。我們的這些結果第一次清楚地闡明了Mcl-1可以和Puma相互作用，而且暗示了Mcl-1可能通過和Puma結合而提高自身穩(wěn)定性最終行使抗凋亡的功能。 另外，我們在研究中發(fā)現(xiàn)促凋亡Bcl-2家族蛋白Noxa的蛋白水平在喜樹堿(CPT)誘導的細胞凋亡中可以被上調，而且這一過程是不依賴于p53的。除此之外，我們證明了P13K/Akt信號通路在

4、CPT誘導的Noxa上調過程中起著非常重要的作用。luciferase assay以及CREB knock-down的實驗結果進一步顯示CREB介導了CPT誘導的Noxa轉錄水平的上調。更重要的是，用RNAi的方法將Noxa的蛋白水平抑制之后可以顯著地抑制CPT誘導的細胞凋亡，暗示Noxa在CPT誘導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。有意思的是，Mcl-1的蛋白水平也可以通過P13K/Akt信號通路而被CPT上調。通過免疫共沉淀實驗，

5、我們證明了不管有沒有CPT處理的情況下Noxa都可以和Mcl-1相互作用，說明Noxa和Mcl-1之間應該存在一個平衡，從而調節(jié)細胞凋亡。通過抑制Mcl-1的蛋白水平以及在細胞內過量表達Mcl-1的實驗，我們發(fā)現(xiàn)Mcl-1蛋白水平的抑制會使得細胞對于CPT誘導的細胞凋亡更加的敏感，而過量表達Mcl-1則可以顯著地抑制CPT以及CPT和LY294002誘導的細胞凋亡。綜合這些結果說明N0×a和Mcl-1之間的平衡可以調節(jié)細胞對于CPT誘導

6、細胞凋亡的敏感度。綜上所述，我們的實驗結果暗示了Mcl-1可以通過和Puma以及Noxa相互作用從而發(fā)揮其抗凋亡功能。 Siah-1(seven in absentia homolog)可以和SIP(Siah-1-interacting protein)，Skp1，以及Ebi相互作用形成一個泛素連接酶復合物從而降解β-catenin。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個新的Siah-1剪切異構體并將它命名為Siah-1S，Siah-1

7、S被證明是通過自身剪切而產生的。有意思的是，Siah-1在剪切的過程中產生的內含子并不符合經(jīng)典的內含子邊界：GT-AG或AT-AC。通過比較Siah-1和Siah-1S的蛋白半衰期，我們發(fā)現(xiàn)Siah-1S比Siah-1更加的不穩(wěn)定；和Siah-1類似，Siah-1S也可以發(fā)生自身泛素化并最終通過泛素-蛋白酶體途徑而被降解。Siah-1S可以提高β-catenin的蛋白水平以及增強Tcf/Lef的轉錄活性，而且Siah-1S可以對抗Sia

8、h-1對于Etoposide誘導的細胞凋亡的增強作用。另外我們發(fā)現(xiàn)Siah-1S不僅可以和Siah-1結合形成異源二聚體，也可以和自身形成同源二聚體。和Siah-1<'*>Siah-1二聚體不同，Siah-1<'*>Siah-1S、以及Siah-1S<'*>Siah-1S都失去了和SIP的結合能力，這個結果可以部分地解釋為什么Siah-1S可以行使Siah-1的dominant negative抑制子的作用。最后我們證明了Siah-1S