應激對兔在體心缺血預適應心肌保護作用的影響及機制.pdf

1、已經(jīng)證實缺血預適應有心肌保護作用，并且在不同種屬的在體心、離體灌注心和心肌培養(yǎng)細胞中得到證實。經(jīng)典IPC機制認為，亞致死的損傷刺激造成內源性保護介質釋放，這些介質作為第一信使通過G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)激活胞內以PKC活化為中心的細胞保護通路，從而啟動細胞本身固有的保護作用，伴隨應激啟動的兒茶酚胺物質也可作為第一信使協(xié)同保護，那么，應激反應只是附帶的協(xié)同了這種機制，還是整體上積極的參與或者主導了IPC作用?本研究首次將應激系統(tǒng)從IPC

2、中分離出來以期分別考察應激和細胞內部固有保護通路各自在心肌保護中的作用。實驗分以下四個部分： 第一部分去應激缺血再灌注動物模型的建立。 目的：考察依托咪酯對應激反應的削弱作用及其循環(huán)穩(wěn)定性，建立藥物去應激動物模型。 方法：24只日本大白兔隨機分為4組(n=6)：1)IPC組；2)依托咪酯一次劑量組； 3)依托咪酯兩次劑量組；4)對照組。實驗中監(jiān)測心率及平均動脈壓變化，同時多時點采血測血漿皮質醇濃度。 結果

3、：依托咪酯兩次劑量組(DOSE2)組平均動脈壓基本在90-118mmHg之間，心率在165±31 beat/min-192±23 beat/min之間，T3-T8各時間點血漿皮質醇濃度依托咪酯兩次劑量組(DOSE2)與IPC組比較，P<0.05。 結論：依托咪酯二次劑量組明顯鈍化皮質醇反應，并能保持心率、平均動脈壓的相對穩(wěn)定。 第二部分應激系統(tǒng)對心肌缺血預適應保護作用的影響。 目的：考察削弱了應激反應的缺血預適應

4、心肌保護作用的變化。 方法：30只家兔隨機分為5組，缺血預適應組(IPC)；缺血再灌注組(IR)；依托咪酯組(Etom)；甲基強的松龍組(MP)；對照組(control)。以心肌梗死面積/缺血面積、血清肌酸激酶(CK)活性和血清肌鈣蛋白I(cTnI)濃度為檢測指標，同時檢測血清皮質醇動態(tài)變化。 結果：IPC組、Etom組、IR組和MP組和control組心肌梗死面積/缺血面積分別為5.9％±2.8％，11.3％±3.6％

5、，26.8％±44.5％， 18.2±3.7％，CK活性增高值(U/L)分別為255±89，768±404，855±371，314±160，120±41，cTNI增高值(μg/l)分別為3.6±0.6，6.4±1.6，8.1±3.6， 6.1±2.2，1.8±0.2。Etom組與IPC組比較，各指標均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論：鈍化皮質醇反應可明顯削弱IPC的保護作用，提示IPC保護作用中可能有應激反應的參與。

6、 第三部分應激系統(tǒng)對缺血預適應心肌細胞凋亡的影響。 目的：考察削弱了應激反應的缺血預適應心肌細胞凋亡的變化及其分子機制。 方法：實驗分組同第二部分，以DNAladder、TUNEL染色、Hoechst染色考察心肌細胞的凋亡程度。用免疫組織化學方法顯示bcl-2和bax在細胞內的表達。 結果：Etom組DNA ladder顯示的條帶比IPC組明顯增多，TUNEL染色計算的凋亡率分別為IPC組1.7％±0.2％，MP

7、組2.3％±0.8％， IR組3.8％±1.3％，Etom組3.0％±0.4％。Hoechst染色計算的凋亡率分別為IPC組3.5％±0.4％，MP組4.1％±0.9％，IR組7.6％±0.4％，Etom組6.2％±1.6％。兩種方法所測凋亡率Etom組與IPC組比較差異均有統(tǒng)計學意義，MP組與IR組比較差異有統(tǒng)計學意義。免疫組化染色顯示IPC組、Etom組、IR組、MP組的bcl-2/bax比值，以積分光密度比值測量分別為0.597±

8、0.047，0.178±0.030，0.146±0.181，0.168±0.021；以陽性面積比比值測量分別為O.740±0.102，0.251±0.055，0.197±0.048，0.213±0.023。Etom組與IPC比較差異均有統(tǒng)計學意義，MP組與IR組比較差異沒有統(tǒng)計學意義。 結論：鈍化應激反應可削弱IPC的細胞凋亡抑制作用，其機制可能是通過削弱IPC的Bcl-2/bax上調表達作用實現(xiàn)的，甲基強的松龍可抑制缺血再灌注

9、損傷的心肌細胞凋亡，但可能與bcl-2/bax表達無關。 第四部分應激系統(tǒng)對IPC的PKC膜向遷移的影響。 目的：考察削弱應激反應對PKC膜向遷移的影響。探究應激反應影響缺血預適應保護作用的分子機制。 方法：實驗分4組(n=6)：1)IPC組，2)缺血再灌組(IR)， 3)依托咪酯組(Etom)，4)甲基強的松龍組(MP)。均在原擬缺血30min的缺血期進行到10min時采集心臟標本，分離胞膜胞漿蛋白組分，分別用

10、酶活性和蛋白印跡檢測PKC的膜向遷移程度。 結果：Etom組、IPC組、IR組和MP組的PKC膜向遷移指數(shù)以酶活性檢測的分別為0.32±0.06，0.38±0.04，0.25±0.03，0.29±0.03；以westem-blotting測定的分別為0.49±0.08，0.58±0.06，0.47±0.06，0.50±0.04，Etom組與IPC組比較差異具有統(tǒng)計學意義，MP組與IR組比較差異沒有統(tǒng)計學意義。結論：IPC可促使P

11、KCε膜向遷移，削弱了應激反應使PKCε膜向遷移減少，應激促進PKCε的膜向遷移從而協(xié)同缺血預適應保護作用可能是它的分子機制之一。甲基強的松龍的心肌保護作用可能與PKCε膜向遷移無關。 總結：鈍化皮質醇反應可明顯削弱IPC的保護作用，削弱應激的促PKCε膜向遷移從而減弱缺血預適應保護作用可能是它的分子機制之一。鈍化應激反應可削弱IPC的細胞凋亡抑制作用，其機制可能是通過削弱IPC的Bcl-2/bax上調表達作用實現(xiàn)的。創(chuàng)新點：

12、 1、從應激功能和整體水平拓展經(jīng)典的IPC理論，首次將應激系統(tǒng)在缺血預適應心肌保護中的作用分離出來，并研究了其可能的分子機制。將缺血預適應的機制從理論上進一步拓展，經(jīng)典的缺血預適應理論可能也是應激系統(tǒng)的細胞反應部分。 2、非手術法去應激動物模型的建立。依托咪酯藥物去應激動物模型的建立為基礎和臨床研究提供簡單可靠的研究工具。 展望： 這一理論上的創(chuàng)新可能為心肌預適應方式的選擇提供一種新的思路，預適應發(fā)現(xiàn)已有3

13、0年歷史，但遲遲不能在臨床上應用，主要原因就在于預適應缺血損傷的直觀性和其保護作用的間接證據(jù)性，因此，如果繞過預適應中缺血損傷操作，行各種模式的應激激發(fā)干預，或者藥物對應激的兩大核心反應軸進行調制模擬出應激，如果起到保護作用，其臨床推廣可行性相對較好，尋求預適應保護可能只是尋求合適的應激模式。不足：離體灌注心和心肌細胞培養(yǎng)的IPC證明細胞固有保護通路可不依賴應激參與而存在，但要研究應激對IPC的影響只能用在體心臟，在體心完全屏蔽掉下丘腦

14、-垂體-腎上腺皮質軸和交感腎上腺軸理論上不可能實現(xiàn)，依托咪酯抑制了應激反應下丘腦一垂體前葉一腎上腺皮質軸的主要產物皮質醇，對交感腎上腺軸幾乎沒有影響，事實上只相當于抑制了應激反應的部分功能，所以本課題題目定為皮質醇對IPC保護作用的影響似乎更為妥貼，但考慮到皮質醇是應激反應激素網(wǎng)絡的最重要的成分，理論上講，打破了應激反應各組分的平衡應該對應激造成很大干擾，從功能上講，事實上對應激反應造成了負面影響，并且，本課題重心在于應激對IPC的影響