BMSCs和HAPO治療異丙腎上腺素誘導的DCM的實驗研究.pdf

1、擴張型心肌病(dilatedcardiomyopathy，DCM)為原發(fā)性心肌病中最常見的類型，是繼冠心病、風濕性心臟病、先天性心臟病之后的常見心臟疾病，更是造成充血性心力衰竭的主要原因之一，且常伴心力衰竭及多種惡性心律失常，目前尚無理想的治療方法。盡管病因不明，但心肌細胞的喪失和纖維組織增生是心功能衰竭的根源。因此，具有自我更新和多分化潛能的干細胞和促進血管生成的細胞因子逐漸進入人們的視線并成為研究熱點。現已證實，骨髓間充質干細胞(B

2、onemarrowmesenchymalcells，BMSCs)在體內可分化為心肌細胞，并改善心功能。細胞的植入方式有多種，但不同方式之間的療效比較尚未見報道，而經左室心腔內注射植入較經靜脈植入細胞外周滯留少，又較心肌內注射簡便易行，故將其與左室心肌內局部注射植入的效果進行比較，以為選擇最佳方式提供依據。促血液血管細胞生成素(Hemangiopoietin，HAPO)，是一種對原始成血細胞系和內皮細胞系的生存和增殖均有支持作用的新型生長

3、因子，據報道，具有促進骨髓干細胞增殖作用、抗細胞調亡作用和機體的放射性保護作用。鑒于促血管新生和抗細胞調亡在干細胞移植和細胞因子修復心肌損傷中所起的重要作用，本試驗又將HAPO應用到異丙腎誘導的心肌病動物模型，以觀療效，并對其機制進行探討。 方法：本研究利用經肌肉注射異丙基腎上腺素(Isoproterenol，Iso)85mg/kg/次，每日1次，連續(xù)3日，共3次，總量為255mg/kg，可成功建立Iso誘導大鼠DCM模型，為進

4、一步的研究提供可靠平臺。經超聲心動、血流動力學檢測及病理組織學檢查證實后，分為左室心腔內注射移植組、左室心肌內局部注射移植組和等量生理鹽水左室心肌內注射組，每個亞組n=10；HAPO治療組(每次300μg/kg，腹腔注射，1次/日×14天)和生理鹽水注射對照組，每個亞組n=10。采用超聲心動及生理多導儀檢測各組射血分數(EF)、短軸縮短率(FS)、左室收縮末期內徑(LVDs)、左室舒張末期內徑(LVDd)、左室收縮壓峰值(LVSP)、左

5、室舒張末壓(LVEDP)以及左室壓力最大上升或下降速率(+dp/dtmax，-dp/dtmax)等心功能指標；采用普通病理學及Masson氏三色素染色進行組織病理學檢查；應用Westernblot法行凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Fas檢測；免疫組化染色行VEGF和CD34抗原檢測；RT-PCR半定量法行VEGF、SDF-1、CXCR、MMP-2、MMP-9、TGF-β1、CollagenI和CollagenⅢmRNA表達水平檢測；免

6、疫熒光染色后于共聚焦顯微鏡下行移植細胞鑒定、定位和定性檢查。 結果：(一)第一部分：經Iso誘導的DCM大鼠模型，在心功能、血流動力學檢測及組織病理等方面均符合DCM的改變。 (二)第二部分：1.BMSCs左室心腔內注射植入組、心肌內局部注射植入組與對照組相比：EF(84.64±4.32％，82.62±5.06％vs66.73±2.94％)、FS(56.58±5.62％，55.25±4.54％vs38.27±4.12％)

7、、LVSP(119.7±12.3mmHg，111.2±11.6mmHgvs85.15±3.35mmHg)、+dp/dtmax(7563.8±578.6mmHg/s，7157.6±632.2mmHg/svs4462.2±368.7mmHg/s)和-dp/dtmax(5104.6±326.9mmHg/s，5013.6±312.6mmHg/svs4258.7±347.3mmHg/s)均有明顯升高(P＜0.05)，而LVDd(6.12±0.31

8、mm，6.06±0.36mmvs6.82±0.31mm)、LVDs(2.47±0.15mm，2.91±0.36mmvs4.56±0.43mm)和LVEDP(9.3±2.3mmHg，11.5±2.4mmHgvs20.4±3.7mmHg)均明顯降低(P＜0.05)。2.左室心腔內注射植入組與心肌內局部注射植入組相比，在EF、FS、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVDd、LVDs、LVEDP等方面無明顯差異(P＞0.05)

9、。3.經免疫熒光檢測證明，無論左室心腔內注射植入組還是心肌內局部注射植入，BMSCs均可植活并能分化為心肌細胞。心肌內注射組的BMSCs早期于心肌內大體上呈帶狀的區(qū)域性分布，而心腔內注射組BMSCs則呈分散的粟粒樣、局灶性分布，更具靶向性和優(yōu)越性。4.左室心腔內注射植入組、心肌內局部注射植入組與對照組比較：凋亡相關蛋白Bcl-2表達增高、Bax表達降低，而二者間無顯著差異(P＞0.05)。5.BMSCs移植組與對照組比較，心肌VEGF表

10、達無論在mRNA水平還是在蛋白水平均明顯增加，而不同移植方式組間則無顯著性差異(P＞0.05)；CD34抗原陽性細胞數則依心腔內注射組、心肌內注射組和心肌病對照組順序遞減。(6.62±0.64個/0.2mm2，4.13±0.7個/0.2mm2vs1.12±0.42個/0.2mm2，P＜0.05)。7.SDF-1和CXCRmRNA表達水平依心腔內注射組、心肌內注射組和對照組順序遞減。8.對照組部分肌原纖維溶解，心肌纖維斷裂，呈灶性壞死；心

11、肌細胞間隙增寬、膠原纖維增多，而BMSCs移植組上述情況均明顯好轉。 (三)第三部分：1.HAPO組與心肌病對照組比較，EF(87.43±7.21％vs81.96±6.03％)、FS(59.74±3.65％vs35.28±3.24％)、LVSP(132.6±5.4％vs89.2±7.4％)、+dp/dtmax(6418.8±378.5vs4353.8±265.8mmHg/s)和-dp/dtmax(6170.3±202.3mmHg

12、/svs4271.5±256.6mmHg/s)明顯升高(P＜0.05)，而LVDd(4.82±0.19vs6.52±0.53mm)、LVDs(2.43±0.22mmvs4.52±0.32mm)和LVEDP(13.3±1.8mmHgvs19.5±2.6mmHg)則顯著降低(P＜0.05)。2.DCM對照組部分肌原纖維溶解，心肌纖維斷裂，呈灶性壞死；心肌細胞間隙增寬、膠原纖維增多，而HAPO治療組上述情況明顯好轉。3.HAPO治療組與對照組

13、比較，心肌VEGF的蛋白表達和CD34抗原陽性細胞數明顯增加，而MMP-2和MMP-9抗原表達水平降低，差異有顯著性(P＞0.05)。4.與對照組比較，HAPO治療組的VEGF和Ⅰ型膠原mRNA表達水平顯著增高(P＜0.05)，TGF-β1、MMP-2和MMP-9mRNA表達水平明顯降低(P＜0.05)，而Ⅲ型膠原無顯著變化(P＞0.05)。5.與鹽水注射對照組比較，HAPO治療組促凋亡蛋白Fas表達明顯降低(P＜0.05)。

14、結論：1.本實驗發(fā)現，經肌肉注射異丙腎上腺素85mg/kg/次，每日1次，連續(xù)3日，共3次，總量255mg/kg，可成功建立Iso誘導大鼠DCM模型，以為進一步的研究提供可靠的研究平臺。2.植入BMSCs治療Iso誘導的DCM，無論經左室心腔內注射和心肌內局部注射植入均可使擴大的心臟明顯縮小并顯著改善心臟功能。3.BMSCs心腔內注射植入在心肌內具有更好的靶向性和優(yōu)越性。4.予以BMSCs移植治療Iso誘導的DCM，無論左室心腔內注射還

15、是心肌內局部注射植入均可在心臟成功植活并分化為心肌細胞。心肌新生以多細胞的歸巢、聚集、融合和分化為主。5.BMSCs移植組與對照組比較，抗凋亡蛋白表達增強，促凋亡蛋白表達減弱，提示移植細胞也可能通過某種機制影響心肌細胞凋亡。6.經左室心腔內注射和心肌內局部注射植入MSC治療Iso誘導的DCM，兩者在療效上無顯著差異，在抑制細胞凋亡和組織學改變上亦無顯著差別。7.在SDF-1、CXCR4表達和CD34抗原陽性細胞數增高的程度上，心腔內注射