抗根結線蟲基因的克隆、遺傳轉化及黑籽南瓜再生體系的建立.pdf

1、根結線蟲(Meloidogyne spp.)是專性植物寄生性病原生物,在根部侵染過程中對植物本身的基因進行調控,以誘導植物細胞特化,形成特化的取食結構,危害2000多種植物；病害發(fā)生后,一般減產10％-20％,嚴重的達75％以上：有證據表明,每年導致農作物和植物的損失超過1000億美元。近年來,隨著對線蟲侵染方式,植物自身抗病防御體系研究的不斷深入,以及分子生物學理論和生物工程技術的不斷發(fā)展,為利用植物自身防御體系及線蟲自身生理生化特點

2、,通過基因工程手段,建立一個具有高效、經濟、環(huán)保的線蟲綜合控防策略成為可能。為此,我們開展了抗根結線蟲基因工程的研究。本文主要研究結果如下： 1 克隆了受根結線蟲誘導的根結特異性表達的啟動子RKNIP,登陸GenBank號為DQ486886,模序分析表明,RKNIP500具有雙向啟動子的功能,而RKNIP300不具有啟動子的功能,但是存在大量的與啟動子功能相關的元件,特別是具有25個在根內特異性表達的元件。該啟動子誘導抗根結線蟲

3、基因在根結內表達,可是作物達到抗根結線蟲的目的。 2 參照NCBI GenBank(accession number AF435976)OC-I序列,合成7條引物,并且設計突變位點,然后利用重疊延伸技術,克隆了完整的OC-I-Δ-D86突變基因。參照GenBank (DQ087264)公布的16D10編碼序列,設計了2條寡核苷酸序列用于合成16D10基因的雙鏈干擾序列,克隆進了T載體中,命名為pGEM-T-RKNIP300-16

4、D10-33(簡寫為pTT33)。 3 為了便于研究抗線蟲基因功能表達的差異研究,構建了四個植物表達載體,分別為pRTO、pRO、pRT33、pRTOT33。其中pRTO為TobRB7△0.3:OC-I-ΔD86;pRO為CaMV35S:OC-I-ΔD86;pRT33為TobRB7△0.3:16D10-33; pRTOT33為CaMV35S: OC-I-ΔD86與Tob△0.3:16D10-33的雙價基因載體系統(tǒng)。為抗根結線蟲植

5、物基因工程的遺傳轉化研究打下了基礎。 4 將OC-IΔD86因克隆到原核表達載體pet21b中,在1mmol/L的IPTG誘導后5h,OC-IΔD86合基因在大腸桿菌中得到表達,表達產物處于可溶狀態(tài),其表達量占總蛋白的11.4％,可溶性蛋白的16.4％；利用Ni-NTA系統(tǒng)純化該蛋白并經PEG20000濃縮；活性分析表明該蛋白酶抑制劑在體外表現出對木瓜蛋白酶明顯的抑制作用；制備了效價大于10000的鼠抗血清。這為抗根結線蟲基因(

6、OC-IΔD86)的轉基因植株的驗證奠定了基礎。 5 通過農桿菌介導法,將三個載體pRTO、pRT33、pRO,分別轉入煙草,其中pRTO、pRO獲得了發(fā)育正常的再生植株；而轉pRT33基因的煙草表型發(fā)生變化,表現為葉片由橢圓形變?yōu)榱~形,且葉片叢生,葉色黃花,不能發(fā)育成正常植株。對轉pRTO基因的煙草植株進行了PCR、SOUTHERN、ELISA檢測及表型檢測,證明pRTO基因已成功轉入煙草中,并表達出了抗性蛋白,轉基因植株表

7、現了明顯的抗根結線蟲的效果。 6 黑籽南瓜是一種非常優(yōu)良的瓜類嫁接砧木材料,單是不抗根結線蟲。為了使其獲得抗根結線蟲的特性,首先開展黑子南瓜再生體系的研究。結果表明：以子葉為外植體,基本培養(yǎng)基為MS,合適的芽誘導激素濃度為BA(2.0mg/l)、TDZ(1.0mg/l)、ZT(2.0mg/l),不定芽再生率分別為91.67％、98.33％、91.67％,KT誘導效果較差；合適的芽伸長培養(yǎng)基為MS+0.25mg/L KT,80％-