水稻白葉枯病菌磷酸二酯酶PdeR互作蛋白鑒定及其功能研究.pdf

1、水稻白葉桔病是由黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo)侵染引起的，是世界水稻生產上重要的細菌病害之一。病原菌主要通過水孔或傷口侵入水稻木質部，Ⅲ型分泌系統及其效應子、胞外多糖(EPS)、胞外酶等毒性因子在Xoo致病性中起關鍵作用。c-di-GMP是細菌中廣泛存在的第二信使，可以調控生物膜形成、運動性、毒性、細胞周期等生物學表型，含有GGDEF結構域的鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)和含有EAL

2、或HD-GYP結構域的磷酸二酯酶(PDE)分別控制c-di-GMP的合成與降解。本實驗室前期研究表明，PdeR是一個含有GGDEF-EAL-REC多結構域的應答調節(jié)蛋白，具有PDE酶活性降解c-di-GMP，與組氨酸激酶PdeK組成一對雙組份系統，參與調控EPS產生和Xoo毒性。為了進一步探索PdeR對Xoo毒性調控的分子機理，本研究從尋找PdeR的互作蛋白入手，并對互作蛋白的功能進行解析，旨在闡明PdeR的作用機制，為全面揭示c-di

3、-GMP信號途徑和細菌致病機理提供更多的科學依據。取得的主要進展如下:
　　1.PdeR互作蛋白的篩選和鑒定
　　本研究構建了PXO99A菌株的cDNA文庫，采用酵母雙雜交(Y2H)方法，以PdeR蛋白為誘餌蛋白，進行了cDNA文庫篩選，以獲得PdeR的互作蛋白。Y2H和GST pull-down驗證了2個互作蛋白PXO04421(命名為TriP)和PXO_00987。發(fā)現隨著互作反應體系中c-di-GMP濃度增加，TriP

4、與PdeR結合作用受到抑制。TriP為OmpR/PhoB家族轉錄調控因子之一，其N端含有信號接收結構域(REC)、C端含有DNA結合結構域(HTH)，推測可能具有調控下游基因轉錄的功能。PXO_00987為乙酰轉移酶之一，其編碼基因位于Xoo鞭毛基因簇的糖基化島中，推測其可能參與調控鞭毛運動性。
　　2.轉錄調控因子TriP功能研究
　　本研究首先通過同源置換法構建了triP缺失突變體(ΔtriP)，進一步測定了其表型及毒性

5、變化。結果發(fā)現與野生型PXO99A相比，triP突變后EPS產量降低、Xoo毒性減弱，但鞭毛運動性未受影響，與pdeR突變體表型一致，表明兩者可能位于同一信號通路中。進一步通過RNA-seq技術分析ΔtriP及ΔpdeR突變體中差異基因表達情況，發(fā)現ΔtriP突變體傾向于激發(fā)一些基因的高表達，而ΔpdeR突變體除了能夠激發(fā)一些基因高表達外，更傾向于抑制一些基因的表達，兩者既有共同的調控通路，也有各自不同的調控通路。
　　3.乙酰轉

6、移酶PXO_00987功能研究
　　本研究通過同源置換法構建了PXO_00987基因缺失突變體(ΔPXO_00987)，進一步測定了突變體的表型及毒性變化。發(fā)現與PXO99A相比，ΔPXO_00987的EPS產量降低、鞭毛運動性增加、生物膜形成減少及Xoo致病性減弱，我們推測Xoo致病性減弱可能與毒性因子減少有關。此外，PXO_00987位于預測的糖基化島中，可能參與鞭毛蛋白翻譯后修飾作用，因此從野生型及ΔPXO_00987突變體

7、中提取鞭毛蛋白進行糖基化檢測，發(fā)現ΔPXO_00987中鞭毛素(FliC)蛋白糖基化作用缺失，表明PXO+00987可能參與了FliC糖基化修飾。
　　4.PdeR亞細胞定位研究
　　本研究通過構建PdeR-GFP融合表達載體，觀察其亞細胞定位，發(fā)現PdeR主要定位在細胞兩極。進一步研究結構域對其定位的影響，發(fā)現GGDEF及REC結構域缺失后影響PdeR的極端定位;同時研究了互作蛋白PdeK、TriP對PdeR定位的影響，發(fā)

8、現TriP影響PdeR的極端定位，因此，PdeR亞細胞定位受到互作蛋白TriP的影響，且REC、GGDEF結構域是影響PdeR亞細胞定位的關鍵結構域。
　　總之，本研究通過對PdeR互作蛋白功能的研究，表明反應調控因子TriP參與了PdeR介導的c-di-GMP信號途徑，而乙酰轉移酶PXO_00987具有自己的調控功能，參與鞭毛蛋白糖基化修飾過程，是否參與PdeR介導調控途徑尚不清楚。通過對PdeR亞細胞定位研究，發(fā)現PdeR主要