豬偽狂犬病病毒gE基因核酸探針的制備及應用.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)又稱Aujeszky氏病，是由偽狂犬病病毒引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽及野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬一般除外）、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的重要傳染病。在根除偽狂犬病的過程中，疫苗扮演了重要的角色。在各種疫苗中基因缺失疫苗是應用最廣泛的，目前商業(yè)化基因缺失疫苗普遍缺失了gE基因，甚至立法規(guī)定只允許gE(gI)基因缺失疫苗使用。本試驗根據(jù)我國目前廣泛使用的偽狂犬疫苗大多缺失gE基因這一特性，克

2、隆了PRV-S株gE基因的部分序列，分析了序列的結(jié)構(gòu)、同源性，對PRV-S株gE基因的部分序列進行了PCR擴增，并用地高辛將擴增產(chǎn)物標記制成核酸探針，用制備的核酸探針進行了臨床病料的檢測。通過一系列試驗，本試驗取得如下的成果:
　　 1.根據(jù)GenBank收錄的PRV-Min-A株(登錄號為AY170318)、PRV-LA株(登錄號為AY173124)、PRV-Ea株（登錄號為AF171937）、Korea株（登錄號為AY249

3、861）及AF207700株的gE基因保守序列設(shè)計一對引物，運用PCR方法從PRV-S株基因組中克隆了304bp的gE基因DNA部分序列。該序列與以上五株不同地域的野毒gE基因序列經(jīng)DNAStar軟件比較后發(fā)現(xiàn)核苷酸序列的同源性均在98％以上，說明該片段可用于制備核酸探針來檢測豬偽狂犬病野毒感染。
　　 2.以含有g(shù)E基因部分序列的重組質(zhì)粒為模板進行了PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)地高辛標記后制成gE基因核酸探針。特異性檢測該探針只與P

4、RV-S株DNA有陽性反應，而與PRVBartha-k61株疫苗毒DNA、PPVDNA、PCVDNA、PRRSVcDNA、CSFVcDNA反應均為陰性，說明該核酸探針具有良好的特異性。敏感性檢測說明該探針至少可檢測到4pg的DNA片段，具有較好的敏感性。
　　 3.用制備的gE基因核酸探針對臨床采集的32份豬繁殖障礙病料進行了斑點雜交檢測，結(jié)果4份病料呈現(xiàn)陽性反應。而同時用針對gE基因設(shè)計的引物對32份病料進行PCR檢測，也檢出