小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞SCA-1+CD45+CD31+亞群向心肌樣細胞分化機制的實驗研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行了論述。
　　第一部分 促心肌分化基因篩選
　　目的:對SCA-1+CD45+CD31+、SCA-1+CD45+CD31-、SCA-1+CD45-CD31+、SCA-1+CD45-CD31-四個亞群基因芯片結(jié)果通過Real-timePCR篩選出在SCA-1+CD45+CD31+亞群表達最高的基因。
　　方法:根據(jù)基因芯片結(jié)果篩選出在SCA-1+CD45+CD31+亞群表達量最高的基因,包括myl3、

2、Itga4、Epor、Rock2、Cxadr、設(shè)計引物。提取SCA-1+CD45+CD31+、SCA-1+CD45+CD31-、SCA-1+CD45-CD31+、SCA-1+CD45-CD31-四組亞群細胞及未分選群細胞的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行Real-timePCR檢測各基因在四組亞群及未分選群細胞中的表達量。
　　結(jié)果:經(jīng)Real-timePCR檢測,Itga4在未分選組中表達最高、Epor在SCA-1+CD45-CD

3、31+亞群中表達最高、Rock2在SCA-1+CD45-CD31-亞群中表達最高、Cxadr在SCA-1+CD45-CD31-亞群中表達最高,myl3在SCA-1+CD45+CD31+亞群中表達最高,且與其他亞群及未分選群比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:myl3在SCA-1+CD45+CD31+亞群中表達量明顯高于其他三個亞群及未分選群。myl3為肌球蛋白輕鏈家族中一員,是肌小節(jié)粗肌絲的組成部分,屬于堿性輕鏈慢肌/心

4、室肌型,目前研究表明其在肌肉再生,促進肌肉收縮方面有重要作用,而目前尚未有研究其在促進心肌分化方面的作用。
　　第二部分 小鼠心梗模型的建立
　　目的:開胸直視下結(jié)扎小鼠冠狀動脈前降支,成功建立小鼠心肌梗死模型,進行體內(nèi)實驗。
　　方法:24只雄性C57BL/6小鼠,體重在14-22g,分為心梗組(n=12),假開胸組(n=12),常規(guī)麻醉,固定小鼠,氣管切開插管,開胸,找到前降支,結(jié)扎,心梗建立成功,逐層關(guān)胸后拔氣管

5、插管。比較結(jié)扎前后心電圖,心超及組織學變化。
　　結(jié)果:結(jié)扎后心電圖導聯(lián)ST段明顯抬高,>0.2mv,術(shù)后四周心超提示心梗組EF和FS值較假開胸組明顯下降(P<0.05),左室舒張末期內(nèi)徑和左室收縮末期內(nèi)徑明顯增加(P<0.05),心臟HE染色證實建模成功。
　　結(jié)論:氣管插管開胸直視下行小鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)成功建立小鼠心梗模型。
　　第三部分 myl3促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的體外研究
　　

6、第一節(jié)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:從小鼠骨髓中分離出有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)。為進一步的實驗研究提供可靠的細胞。
　　方法:小鼠全骨髓培養(yǎng)。流式鑒定細胞表面抗原表達。
　　結(jié)果:體外培養(yǎng)的原代MSCs10-14d達到融合,結(jié)果顯示超過90％小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞性表達CD29(細胞整合素分子)、CD90(粘附分子)和CD44

7、(粘附分子,介導細胞對透明質(zhì)酸和骨橋蛋白的粘附);但不表達造血祖細胞表面標志 CD11b、CD133。
　　結(jié)論:利用MSCs貼壁特性,在體外條件下成功分離、培養(yǎng)和擴增了小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,用于下面體內(nèi)體外研究。
　　第二節(jié)轉(zhuǎn)染myl3-siRNA檢測心肌特異性因子表達
　　目的:將合成的myl3-siRNA轉(zhuǎn)染進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,并檢測轉(zhuǎn)染后的心肌特異性因子的表達。
　　方法:利用lipofactamin

8、TM2000轉(zhuǎn)染試劑將合成好的myl3-siRNA轉(zhuǎn)染進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞作為實驗組(A組),另將空白載體的siRNA轉(zhuǎn)進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞作為對照組(B組),24h倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達檢測轉(zhuǎn)染效率。并用心肌細胞裂解液誘導A組和B組向心肌樣細胞分化。48小時后收集細胞,設(shè)計myl3引物,Real-time PCR檢測其表達量。設(shè)計GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin引物,Real-timePCR檢

9、測心肌特異性因子在轉(zhuǎn)染后的表達。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染效率達60％以上。Real-time PCR檢測myl3表達量較對照組明顯下降。進一步檢測心肌特異性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin,與對照組比均下降。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建myl3-siRNA,轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞后能下調(diào)心肌特異性因子。
　　第三節(jié)構(gòu)建過表達myl3質(zhì)粒
　　目的:構(gòu)建myl3過表達質(zhì)粒,并對構(gòu)建好的質(zhì)粒進行測序鑒

10、定。
　　方法:從含有目的基因的質(zhì)?？寺∧０逯?利用PCR方法釣取目的基因,若沒有模板則利用全基因合成的方法得到目的基因。將目的基因與目的載體分別進行酶切。純化酶切產(chǎn)物后進行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞,對長出的克隆先進行酶切鑒定,證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。再對陽性克隆進行測序和分析比對,比對正確的即為構(gòu)建成功的目的基因表達質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好的過表達質(zhì)粒載體進行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。
　　結(jié)果:雙酶切鑒定及測序結(jié)果

11、證實過表達myl3質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:成功的合成了myl3過表達質(zhì)粒,用于該基因的功能研究。
　　第四節(jié)轉(zhuǎn)染過表達myl3質(zhì)粒檢測心肌特異性因子表達
　　目的:將構(gòu)建好的過表達myl3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,并檢測轉(zhuǎn)染后的心肌特異性因子的表達。
　　方法:利用lipofactaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑將合成好的過表達myl3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞作為實驗組(A組),并用同樣的方法將空白質(zhì)

12、粒轉(zhuǎn)進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞作為對照組(B組),小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞作為空白組(C組)。24h倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達檢測轉(zhuǎn)染效率。48小時后收集細胞,設(shè)計myl3引物, Real-time PCR檢測其表達量。用5-氮胞苷(10umol/L)對A組、B組細胞進行誘導, C組不進行誘導,兩周后抽取RNA,行Real-time PCR檢測GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT的表達量。制備小鼠心肌細胞裂解液,對另一批A組、B組

13、細胞進行誘導,兩周后抽取RNA,行Real-time PCR檢測GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin的表達量。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染效率同樣在60％以上。Real-time PCR檢測myl3表達量較對照組明顯升高,經(jīng)5-氮胞苷誘導后轉(zhuǎn)染了過表達myl3質(zhì)粒的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(A組)其心肌特異性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5的表達量較轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的骨髓間充質(zhì)干細胞(B組)升高,而A組和B組細胞較C

14、組比較上述心肌特異性因子的表達下降,而cTnT表達量在A組明顯高于B組和C組。重復上述實驗,結(jié)果同前。檢測經(jīng)心肌細胞裂解液誘導后的A、B、C組細胞心肌特異性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT的表達量,我們發(fā)現(xiàn)A組>B組>C組,重復實驗結(jié)果同前。我們將經(jīng)心肌細胞裂解液誘導后多檢測的A、B、C組細胞各心肌特異性因子的表達量進行統(tǒng)計學分析,A組的心肌特異性因子的表達較B組高且有統(tǒng)計學差異(P<0.05),B組高于C組且有統(tǒng)計學

15、差異(P<0.05)。進一步行免疫熒光檢測。
　　結(jié)論:myl3過表達后經(jīng)心肌細胞裂解液誘導,能促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化。
　　第五節(jié)心肌特異性因子的免疫熒光檢測
　　目的:從蛋白水平上進一步驗證過表達myl3基因后小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞心肌分化的能力
　　方法:利用lipofactaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑將合成好的過表達myl3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞作為實驗組(A組),并用同樣的方法

16、將空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞作為對照組(B組),制備小鼠心肌細胞裂解液,加入轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)液中,誘導向心肌細胞分化,兩周后行免疫熒光檢測。
　　結(jié)果:經(jīng)心肌細胞裂解液誘導14天后,過表達myl3的骨髓間充質(zhì)干細胞表達更多的心肌特異性因子Cx43,Desmin(圖中發(fā)紅光)。而轉(zhuǎn)染空白載體的骨髓間充質(zhì)干細胞其心肌特異性因子Cx43,Desmin表達量明顯減少。
　　結(jié)論:從蛋白水平進一步證實myl3過

17、表達后能更好促進骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化。
　　第四部分 myl3促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的體內(nèi)研究
　　目的:研究過表達myl3基因的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在心梗的小鼠模型中是否能促進其向心肌樣細胞分化,并改善心功能。
　　方法:選用雄性C57BL/6小鼠24只,體重在14-20g,氣管插管開胸直視下行冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù),建立小鼠心梗模型。小鼠隨機分為四組:轉(zhuǎn)染過表達 myl3的BMSC組(A

18、組,n=6只),轉(zhuǎn)染空白載體組(B組,n=6只),BMSC組(C組,n=6只),PBS組(D組,n=6只)。將四組細胞分別注射進小鼠心梗及周邊區(qū)域,手術(shù)當天及四周后分別檢測心超,評估心功能,四周后處死小鼠,取心臟組織行組織學檢測。
　　結(jié)果:小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植四周后,進行心超檢測,A組EF值較B、C、D組升高,但無統(tǒng)計學差異,(P>0.05),但比較BMSC移植前后EF值的差值,我們發(fā)現(xiàn)A組較其他各組明顯升高且有統(tǒng)計學差異(

19、P<0.05)。FS在注射干細胞前后的差值也在A組最高,且與其他三組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05),A組的左室收縮末期容積和左室舒張末期容積在干細胞注射前后的差值也是最高,且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。心臟Masson染色測量心梗面積,提示A組心梗面積最小,纖維化程度最輕,且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。行心臟特異性抗原Cx43、desmin免疫組化檢測,兩種抗原在A組小鼠心臟中表達明顯,進一步行免疫熒光檢測,過表達myl3的BMS