滑膜組織來源的間充質(zhì)干細胞復合水凝膠支架材料體外構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨缺損常見于關(guān)節(jié)創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)炎，缺損不能自我修復，常導致關(guān)節(jié)內(nèi)其它組織(半月板，交叉韌帶)的進一步損害，最終使關(guān)節(jié)功能喪失，目前，無理想的治療辦法。近年來，隨著干細胞和生物材料研究水平的不斷提高，組織工程在關(guān)節(jié)軟骨損傷修復中扮演著越來越重要的角色。
　　 組織工程就是在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，利用種子細胞復合生物支架材料體外構(gòu)建人體組織或者器官，再移植到體內(nèi)，從而達到治療和修復組織或者器官的目的。目前，在組織工程關(guān)節(jié)軟骨研究領(lǐng)域里

2、，研究熱點主要包括三個方面：(1)種子細胞，(2)生物支架材料，(3)培養(yǎng)環(huán)境。種子細胞主要包括軟骨細胞、胚胎組織來源的干細胞和成體組織來源的干細胞。軟骨細胞是研究最廣泛的一種種子細胞。軟骨細胞屬于終末分化細胞，體外擴增能力有限，容易發(fā)生去分化，并且來源有限。鑒于倫理方面的考慮，胚胎干細胞目前還不能廣泛應用于組織工程關(guān)節(jié)軟骨的研究。成體組織來源的干細胞擁有來源廣泛、容易體外培養(yǎng)和自我增殖等優(yōu)點。在組織工程關(guān)節(jié)軟骨中，成體干細胞被認為是一

3、種非常有前途的種子細胞。當前，已經(jīng)成功地從成體組織分離出的干細胞有骨髓組織來源的干細胞、脂肪組織來源的干細胞、骨膜組織來源的干細胞和肌肉組織來源的干細胞等。隨著對干細胞研究的不斷深入，許多學者認為相關(guān)聯(lián)組織來源的干細胞對人體組織的工程化修復可能有更大的潛能。人體膝關(guān)節(jié)腔被整個滑膜組織所包裹，滑膜組織相連接于關(guān)節(jié)軟骨組織，并且能夠分泌大量的關(guān)節(jié)液，營養(yǎng)和潤滑整個關(guān)節(jié)腔內(nèi)相關(guān)聯(lián)的組織(關(guān)節(jié)軟骨組織，半月板組織)。最近有文獻報道，從關(guān)節(jié)滑膜組

4、織中成功分離出間充質(zhì)干細胞?；そM織來源的間充質(zhì)干細胞應用在組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的修復，已經(jīng)受到越來越多學者的重視。除了干細胞，生物支架材料是另外一個非常重要因素影響關(guān)節(jié)軟骨組織工程的修復。當前，生物支架材料研究主要包括天然支架材料和人工合成支架材料。水凝膠支架材料屬于一種特殊人工合成支架材料，以其高含水性、可塑性和高細胞相容性，被廣泛應用于關(guān)節(jié)軟骨組織工程研究領(lǐng)域。管滑膜組織來源的間充質(zhì)干細胞在關(guān)節(jié)軟骨組織工程修復研究領(lǐng)域里已經(jīng)有一些相

5、關(guān)的實驗研究，但是對其生物學特性和復合水凝膠支架材料后的關(guān)節(jié)軟骨分化潛能，仍然存在許多未知問題。本課題主要從干細胞和生物支架材料兩方面來研究滑膜間充質(zhì)干細胞復合水凝膠支架材料體外構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨組織。課題研究了滑膜間充質(zhì)干細胞的相關(guān)生物學特性(細胞形態(tài)，細胞增殖性，細胞多向分化潛能)。課題還設(shè)計和合成了兩種新穎的水凝膠支架材料(可注射的Gellan水凝膠和可降解的PhosPEG水凝膠)作為滑膜間充質(zhì)干細胞體外三維細胞載體。本研究分為三個部分

6、。
　　 第一章：兔來源的滑膜間充質(zhì)干細胞的生物學特性。
　　 細胞從兔來源的滑膜組織分離后，貼壁培養(yǎng)一段時間。我們采用細胞克隆形成和多向分化潛能兩種方法分析兔滑膜組織來源的間充質(zhì)干細胞生物學特性。實驗結(jié)果表明：
　　 ⑴新鮮分離的兔來源滑膜干細胞體外培養(yǎng)7天后，顯微鏡下觀察它們有成纖維細胞形態(tài)。取第一代滑膜干細胞稀釋種植到細胞培養(yǎng)皿上，體外培養(yǎng)兩周左右，顯微鏡下觀察有細胞克隆形成。體外繼續(xù)培養(yǎng)三周左右，晶紫蘭染

7、色，顯微鏡下觀察有許多大于2mm的細胞克隆形成。
　　 ⑵取第四代的滑膜干細胞進行多向分化潛能分析。①軟骨組織分化：體外誘導21天后，阿爾新藍染色顯示有軟骨基質(zhì)形成。②成骨組織分化：體外誘導14天后，茜素紅染色顯示有大量鈣質(zhì)形成。③脂肪組織分化：體外誘導14天后，油紅染色顯示有脂肪小滴形成。
　　 小結(jié)：兔滑膜組織來源的干細胞表現(xiàn)出間充質(zhì)干細胞的生物學特性：①成纖維狀細胞形態(tài)，②自我增殖能力，③多向分化潛能(軟骨，成骨，

8、脂肪)。
　　 第二章：滑膜間充質(zhì)干細胞復合光聚合水凝膠支架材料向關(guān)節(jié)軟骨分化。
　　 兔滑膜組織來源的間充質(zhì)干細胞復合兩種光聚合水凝膠(PEGDA，PhosPEG)后，在三種不同軟骨誘導液(無生長因子，TGFβ1,TGFβ3)誘導培養(yǎng)21天。我們用Live-Dead Assay、WST-1 Assay、 Biochemical Assay、Real-time RT-PCR和Immunohistochemistry五種方

9、法分析滑膜間充質(zhì)干細胞復合兩種光聚合水凝膠支架材料體外向關(guān)節(jié)軟骨組織分化的能力。
　　 ⑴Live-Dead Assay顯示滑膜間充質(zhì)干細胞在兩種光聚合水凝膠里，都保持較高的細胞活性。在TGFβ1誘導的實驗組，WST-1 Assay顯示滑膜間充質(zhì)干細胞復合在PEGDA水凝膠里的細胞增殖能力大于滑膜間充質(zhì)干細胞復合在可降解PhosPEG水凝膠里。相反，在TGFβ3誘導的實驗組，滑膜間充質(zhì)干細胞在兩種光聚合水凝膠中的細胞增殖能力沒有

10、明顯區(qū)別。
　　 ⑵在所有的實驗組里，滑膜間充質(zhì)干細胞復合在兩種光聚合水凝膠里都實現(xiàn)了向關(guān)節(jié)軟骨組織分化。相比較實驗對照組，Real time RT-PCR和BiochemicalAssay分析表明實驗組的關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)基因和蛋白(Collagen typeⅡ和Aggrecan)的表達都明顯增高。另外，相比較PEGDA實驗組，PhosPEG實驗組的關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)基因和蛋白的表達都明顯降低，但免疫組化分析顯示它們并沒有顯著的區(qū)別。

11、r>　　 小結(jié)：在兩種軟骨誘導液誘導培養(yǎng)21天后，滑膜間充質(zhì)干細胞復合在兩種光聚合水凝膠里，能夠保持良好的生物活性和一定的細胞增殖性?；らg充質(zhì)干細胞在兩種光聚合水凝膠中都實現(xiàn)了向關(guān)節(jié)軟骨組織分化。盡管相比較滑膜間充質(zhì)干細胞復合PEGDA水凝膠實驗組，滑膜間充質(zhì)干細胞復合PhosPEG水凝膠實驗組向關(guān)節(jié)軟骨組織分化能力稍弱一些，但PhosPEG水凝膠具有很好的可降解性，所以滑膜間充質(zhì)干細胞復合PhosPEG水凝膠具有更廣闊的應用前景。

12、
　　 第三章：滑膜間充質(zhì)干細胞復合可注射Gellan水凝膠支架材料體外工程化關(guān)節(jié)軟骨。
　　 兔滑膜組織來源的間充質(zhì)干細胞復合可注射的Gellan水凝膠后，分別在四組軟骨誘導液(無生長因子，TGF-β1，TGF-β3，BMP-2)誘導培養(yǎng)21天和42天。我們采用Live-Dead Assay、WST-1 Assay、Real-time RT-PCR、Biochemical Assay和Histology and Imm

13、unohistochemistry五種實驗方法分析體外組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的效果。
　　 ⑴Live-Dead Assay顯示在第21天時間點里，滑膜間充質(zhì)干細胞在Gellan水凝膠體系里保持較高的細胞活性。
　　 ⑵WST-1 Assay顯示滑膜間充質(zhì)干細胞在所有的實驗組都保持較高的細胞增殖性。
　　 ⑶相比較2D和3D對照組，Real time RT-PCR分析顯示所有實驗組的關(guān)節(jié)軟骨特有的幾個標志基因的表達都

14、有不同程度的增高。相比較BMP2誘導的實驗組，TGFβ1和TGFβ3兩個誘導實驗組的關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)基因的表達有更明顯的增高。另外，Collagen TypeⅠ是成纖維軟骨的主要成分之一，但所有實驗組CollagenTypeⅠ的表達都呈現(xiàn)降低趨勢。
　　 ⑷Biochemical Assay分析顯示sGAG和Collagen總含量在所有實驗組里都有不同程度的增高。相比較TGFβ1和TGFβ3誘導實驗組，BMP-2誘導實驗組的sGAG

15、和Collagen表達有所降低，這與Real-time RT-PCR分析結(jié)果基本一致。
　　 ⑸Immunohistochemistry分析顯示所有實驗組都清晰表達Collagen TypeⅡ和Aggrecan。另外，滑膜間充質(zhì)干細胞在所有實驗組都呈現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)，并且保持高密度。
　　 小結(jié)：在體外軟骨誘導培養(yǎng)21天后，滑膜間充質(zhì)干細胞可注射Gellan水凝膠復合體能夠形成高質(zhì)量的組織工程化關(guān)節(jié)軟骨。在同一劑量下，

16、相比較BMP-2生長因子，TGFβ1和TGFβ3兩種生長因子更能促進滑膜間充質(zhì)干細胞復合在水凝膠支架材料中向關(guān)節(jié)軟骨組織分化。另外，滑膜間充質(zhì)干細胞復合在Gellan水凝膠支架材料中，能夠保持很好的細胞增殖性和細胞相容性。因此，滑膜間充質(zhì)干細胞復合可注射Gellan水凝膠支架材料是一個有前途的策略應用在未來工程化關(guān)節(jié)軟骨組織的構(gòu)建。
　　 結(jié)論：①滑膜組織相連接于關(guān)節(jié)軟骨組織。在關(guān)節(jié)軟骨組織工程中，滑膜組織是一個很好的種子細胞來

17、源。②滑膜組織來源的干細胞具有間充質(zhì)干細胞生物特性：成纖維細胞形態(tài)，自我增殖能力，多向分化潛能。③光聚合水凝膠支架材料可以作為滑膜間充質(zhì)干細胞體外三維細胞載體。相比較不可降解的PEGDA水凝膠支架材料，可降解PhosPEG水凝膠支架材料復合滑膜間充質(zhì)干細胞有更加廣闊的應用前景。⒁滑膜間充質(zhì)干細胞復合可注射Gellan水凝膠體外能夠構(gòu)建高質(zhì)量的關(guān)節(jié)軟骨組織。⑤在同一劑量下，相比較BMP-2生長因子，TGFβ1和TGFβ3兩種生長因子更能促