甲狀腺激素轉運體OATP1C1,MCT8在2VO大鼠腦組織中的表達.pdf

1、研究目的
　　 近年來，血管性認知障礙(Vascularcognitiveimpairment，VCI)越來越受到人們的重視，血管性癡呆(Vasculardementia，VD)是其中的類型之一，它在老年期癡呆的分類中占一定的比重。缺血性病變尤其是多發(fā)性腦梗塞是VD的主要病理基礎，但VD的具體發(fā)病機制還在探索中。據(jù)臨床觀察顯示VD患者存在血清甲狀腺激素(Thyroidhormone，TH)水平異常，而臨床并無甲狀腺功能低下的表現(xiàn)

2、，多數(shù)研究認為此現(xiàn)象屬于非甲狀腺疾病綜合征(Nonthyroidalillnesssyndrome，NTIS)。眾所周知，哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為甲狀腺激素活動的重要靶組織，依賴于甲狀腺激素的供應。在嚙齒類動物腦發(fā)育的關鍵時期，甲狀腺激素的缺乏可影響神經(jīng)元的遷移，生長，分化，突觸的發(fā)生，髓鞘的形成及神經(jīng)膠質細胞的增殖。既往多項研究已證明腦內(nèi)存在相對獨立的甲狀腺激素代謝系統(tǒng)，甲狀腺激素的生物活性很大程度上取決于與細胞核受體結合的T3的濃

3、度。以前一直認為碘化甲腺氨酸可以直接擴散到細胞內(nèi)，但近30年甲狀腺激素的分子生物學研究表明:甲狀腺激素主要通過甲狀腺激素轉運體進出細胞。有機陰離子轉運多肽1C1(Organicaniontransportingpolypeptide1C1，OATP1C1)，單羧酸轉運蛋白8(Monocarboxylatetransporter8，MCT8)是目前被認為是與甲狀腺激素具有高親和力的轉運體。本課題組前期研究應用大鼠雙側頸總動脈永久性結扎術(

4、2-vesselocclusion，2VO)制備慢性腦缺血動物模型，發(fā)現(xiàn)2VO5周大鼠可發(fā)生中樞甲狀腺激素水平的異常并同時伴有認知障礙，補充外源性甲狀腺激素的慢性腦缺血大鼠的水迷宮成績明顯改善，提示慢性腦缺血大鼠的學習記憶障礙與中樞甲狀腺激素水平下降有關，但2VO大鼠中樞甲狀腺激素水平下降是否受甲狀腺激素轉運體OATP1C1與MCT8的調控尚無研究報道。因此本實驗觀察OATP1C1與MCT8在正常大鼠腦組織中的表達并探討它們在2VO術后

5、不同缺血時間點基因與蛋白水平的變化規(guī)律。
　　 研究方法
　　 1.實驗分組:30只清潔級成年雄性SD大鼠，隨機選擇其中5只正常大鼠用于免疫熒光，其余25只正常大鼠隨機分為正常對照組(normal，n＝5)，2VO3天組(A，n=5)，2VO2周組(B，n＝5)，2VO5周組(C，n＝5)，2VO8周組(D，n＝5)。
　　 2.采用免疫熒光法觀察OATP1C1，MCT8在正常大鼠側腦室中的表達。
　　

6、3.各組大鼠于實驗終點采用熒光定量PCR法(Real-timeQuantitativePCR)測定腦組織中TH轉運體OATP1C1mRNA和MCT8mRNA的表達水平。
　　 4.各組大鼠于實驗終點采用免疫印跡法(Westernblotting)測定腦組織中TH轉運體OATP1C1和MCT8的蛋白表達水平。
　　 5.數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，組間比較采用單因素方差(

7、one-wayANOVA)分析，組間多重比較采用Dunnetts3法，以P＜0.05為差異顯著性檢驗界限。
　　 研究結果
　　 1.免疫熒光法觀察到OATP1C1，MCT8在正常大鼠側腦室的血管內(nèi)皮細胞膜上表達豐富。
　　 2.與正常組相比較，甲狀腺激素轉運體OATP1C1mRNA水平在2VO3天組，2VO2周組及2VO8周組差異無統(tǒng)計學差異(P=1.000，P=0.604，P=0.448)，在2VO5周組差異

8、有統(tǒng)計學意義(P＝0.011);與2VO3天組比較，OATP1C1mRNA水平在2VO2周組及2VO8周組差異無統(tǒng)計學意義(P＝0.456，P=0.427)，在2VO5周組有統(tǒng)計學差異(P=O.012);與2VO2周組比較，OATP1C1mRNA水平在2VO5周組有統(tǒng)計學意義(P=0.013)，在2VO8周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.718);與2VO5周組比較，OATP1C1mRNA水平在2VO8周組差異無統(tǒng)計學意義(P＝0.414)

9、。
　　 3.與正常組相比較，甲狀腺激素轉運體MCT8mRNA水平在2VO3天組，2VO2周組及2VO8周組差異無統(tǒng)計學差異(P=1.000，P=0.984，P=0.052)，在2VO5周組差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.046);與2VO3天組比較，MCT8mRNA水平在2VO2周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.883)，在2VO5周及2VO8周組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.042，P=0.031);與2VO2周組比較，MCT8mRNA水

10、平在2VO5周組沒有統(tǒng)計學意義(P=0.054)，在2VO8周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.351);與2VO5周組比較，MCT8mRNA水平在2VO8周組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.135)。
　　 4.免疫印跡法檢測所示在2VO2周組，2VO5周組，2VO8周組條帶均較正常組與2VO3天組加深，這表明2VO術后隨著大鼠腦組織缺血時間的延長，甲狀腺激素轉運體OATP1C1和MCT8蛋白在腦組織中的表達增加。
　　 研究結論

11、
　　 眾所周知甲狀腺激素的生物活性是由細胞內(nèi)的T3濃度決定的，近年來研究發(fā)現(xiàn)T3進入中樞神經(jīng)元有兩種途徑，一種是:1)T4在OATP1C1的參與下通過血腦屏障;2)T4通過不知名的運載體進入神經(jīng)膠質細胞;3)T4在D2脫碘酶的作用下轉化為T3;4)T3通過不知名的運載體從神經(jīng)膠質細胞中被釋放;5)T3被運載體MCT8或另一種載體轉運至神經(jīng)元。另一種途徑是:1)T3由轉運體MCT8轉運通過血腦屏障，再經(jīng)過MCT8或另一種載體攝取

12、至神經(jīng)元。人類SLCO1C1基因編碼OATP1C1蛋白，OATP1C1蛋白包含712個氨基酸，有12個跨膜區(qū)，OATP1C1主要表達在腦組織的血腦屏障和脈絡從，主要轉運T4、rT3和極少量的T3，與T4有高度的特異性，它是T4進入腦組織的關鍵轉運體，其種屬間有顯著差異，大鼠、小鼠的表達高于人類。人類MCT8(SLC16A2)基因位于Xq13.2包括6個外顯子和5個內(nèi)含子。成熟的mRNA長約4.4kb，包含2個翻譯起始位點(TLSs)。由

13、于TLS不同，人類MCT8基因編碼的蛋白有兩種:一種含有613個氨基酸，另一種是含有539個氨基酸。非靈長類MCT8基因缺乏第1位TLS，但第二位與人類同源。MCT8有12個跨膜區(qū)，其N端和C端都位于細胞內(nèi)。N端富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基(簡稱PEST)，539個氨基酸的蛋白N端含有1個PEST;613個氨基酸的蛋白N端含有2個PEST。因此MCT8也稱為X連鎖含有PEST的轉運體(X-linkedPEST—containi

14、ngtransporter.XPCT)。MCT8在不同種屬、不同組織中廣泛分布，如腦、心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、甲狀腺、胎盤。MCT8基因突變導致的AHDS綜合征(Allan-Herndon-Dudleysyndrome)——一類伴有血清T3水平升高的X連鎖精神運動性遲緩綜合癥——使得MCT8在腦發(fā)育中的作用日益受到重視。目前認為甲狀腺激素轉運體MCT8是最具特異性的T3轉運體。本實驗采用免疫熒光法觀察到中樞甲狀腺激素轉運體OATP1C

15、1，MCT8均豐富地表達于正常大鼠大腦側腦室的毛細血管內(nèi)皮細胞膜上，這與之前的研究一致。OATP1C1與MCT8在成年大鼠脈絡叢中的高度表達，提示它們在血腦屏障或血腦脊液屏障轉運甲狀腺激素中發(fā)揮著重要作用。
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血(2VO5周)成年大鼠發(fā)生認知障礙，同時腦組織T3、T4濃度下降，而在急性期及慢性期補充外源性甲狀腺激素的2VO大鼠學習記憶能力均明顯改善，提示慢性腦缺血大鼠的學習記憶障礙與中樞甲狀腺激素

16、水平下降有關，但是2VO大鼠中樞甲狀腺激素水平下降是否受甲狀腺激素轉運體OATP1C1與MCT8的調控尚無研究報道，本實驗采用熒光定量PCR法檢測OATP1C1與MCT8在不同缺血時間點的大鼠大腦中基因水平的表達，發(fā)現(xiàn)隨著缺血時間的延長OATP1C1，MCT8基因水平呈不同程度的代償性增加的趨勢，并在缺血5周時達高峰，這表明大鼠在腦缺血5周時腦組織對甲狀腺激素的需求顯著增加，與我們前期觀察到的2VO5周大鼠腦組織T3、T4濃度下降相對應

17、，說明OATP1C1與MCT8在轉運甲狀腺激素通過血腦屏障及血脈絡叢屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)、及時補充及代償中樞缺失的甲狀腺激素方面發(fā)揮著非常重要的作用。本實驗采用Westernblotting法檢測OATP1C1與MCT8在在不同缺血時間點的大鼠大腦中蛋白水平的表達，發(fā)現(xiàn)隨著缺血時間的延長OATP1C1與MCT8蛋白水平呈不同程度的代償性增加的趨勢，此結果與基因水平的變化基本一致。
　　 盡管隨著缺血時間的延長OATP1C1與MC

18、T8基因水平與蛋白呈不同程度的代償性增加的趨勢，但依然不足以代償缺血大鼠腦組織中減少的甲狀腺激素，原因可能有以下幾點:1.隨著腦組織缺血時間的延長，大鼠的血腦屏障(Blood-brainbarrier,BBB)和脈絡膜-腦脊液屏障(ChoroidPlexus-Cerebrospinalfluidbarrier，CP-CSFB)產(chǎn)生不同程度的損傷，因而影響B(tài)BB和CP-CSFB上皮細胞內(nèi)的OATP1C1與MCT8的代償能力;2.是否腦缺血

19、時中樞神經(jīng)系統(tǒng)甲狀腺激素的代謝過程還存在著其它環(huán)節(jié)的異常，這有待更進一步的研究。
　　 總之，從本實驗中，我們看到，中樞甲狀腺激素轉運體OATP1C1，MCT8都豐富地表達于大腦側腦室脈絡叢的毛細血管內(nèi)皮細胞膜上，這提示它們在血腦屏障或血腦脊液屏障轉運甲狀腺激素中發(fā)揮著重要作用。隨著缺血時間的延長OATP1C1與MCT8基因水平與蛋白呈不同程度的代償性增加的趨勢，雖然不足以代償缺血大鼠腦組織對甲狀腺激素的需求，但是間接反映了腦缺