熱休克蛋白Hsp70ATP-ADP轉換活性及分子伴侶功能研究.pdf

1、熱休克蛋白是細胞受熱等因素刺激后誘導產生的蛋白質，是在生物進化中高度保守的蛋白質分子家族，廣泛存在于從原核到真核各種生物細胞內，后來研究證明熱休克蛋白在正常生理條件下亦表達并起重要作用，其作為分子伴侶參與未折疊新生多肽鏈、多蛋白復合物的組裝和跨膜運輸、轉位、蛋白質降解，細胞內蛋白質合成后的加工等一系列生物活動，保護細胞生存。 Hsp70是熱休克蛋白家族中最重要的一員，其誘導性顯著，合成量較多。Hsp70功能發(fā)揮可能依賴ATP的結

2、合、ATP-ADP的轉換或Hsp70的自身磷酸化所引起構象的變化，進而引起的底物結合和釋放。Hsp70蛋白家族具有一個共同的三級結構：N端高度保守ATPase功能域和C端底物結合功能域。Hsp70N端44-kD的ATPase功能域存在微弱的ATP水解活性，后來發(fā)現(xiàn)Hsp70不僅存在ATP水解活性還存在ATP合成活性，Hsp70表現(xiàn)的是ATP-ADP轉換活性。 本實驗首先以牛腦Hsp70為研究對象，確定Hsp70 ATP-ADP轉

3、換活性發(fā)生部位。用糜蛋白酶酶切Hsp70，獲得了穩(wěn)定的44-kD片段，用C14標記的[14C]ATP生成[14C]ADP的量測定ATPase活性；反過來由[14C]ADP生成[14C]ATP的量測定ATP合成酶活性。為獲得準確的結論排除NDP激酶可能對實驗的影響，按照純化Hsp70 44-kD片段的方法對等物質量NDP激酶和Hsp70混合物進行酶切、純化，檢測得到的44-kD片段的ATP-ADP轉換活性，確定Hsp70 ATP-ADP轉

4、換活性是：Hsp70自身固有的，位于其N端44-kD片段處。 Hsp70與NDP激酶相似通過形成酸或堿不穩(wěn)定自身磷酸化中間體催化γ-磷酸基團在ATP和ADP間傳遞。本實驗研究了酸穩(wěn)定的磷酸中間體的生成。純化后的Hsp70、44-kD蛋白片段與標記的[γ-32p]ATP反應，SDS-PAGE后在酸性條件下處理凝膠，Hsp70與44-kD蛋白片段的放射自顯影圖譜都顯示酸穩(wěn)定的自身磷酸化，推測可能是絲/蘇氨酸磷酸化。用CNBr裂解磷酸

5、化的44-kD蛋白片段，磷酸化片段位于裂解后的12-kD片段，氨基酸測序為Lys128-Met237。賴氨酰肽鏈內切酶酶切、反相分離、氨基酸測序確定磷酸化位點為204位蘇氨酸，與大腸桿菌Hsp70---DnaK的199位蘇氨酸磷酸化一致。 人Hsp70與牛Hsp70無論氨基酸序列還是三級結構都存在高度同源性。本實驗選擇人Hsp70中兩金屬結合位點的3個氨基酸來研究其對Hsp70功能的影響及作用機理。Lys71、Thr204.和H

6、is227分別位于ATPase功能域兩金屬結合位點內，測定Hsp70K71A、T204A突變體ATP-ADP轉換活性發(fā)現(xiàn)二者ATP-ADP的轉換活性幾乎完全喪失，無磷酸化中間體的形成。用變性熒光素酶的重折疊實驗檢測Hsp70的分子伴侶功能，Hsp70K71A、T204A突變體體外幫助變性熒光素酶的重折疊功能受到抑制。H227S突變體的ATP-ADP的轉換活性幾乎完全喪失，但是其磷酸化中間體未受影響，而且體外幫助變性熒光素酶的重折疊功能比