體外發(fā)散式沖擊波物理特性研究及對軟骨細胞和軟骨前體細胞生物學特性影響的初步研究.pdf

1、【研究背景】隨著全民健身運動的推廣普及,運動系統(tǒng)損傷正呈現逐年增加的趨勢,其中關節(jié)軟骨損傷的發(fā)生率很高,對2479例膝關節(jié)手術患者流行病學分布統(tǒng)計[1],其中關節(jié)軟骨損傷者占55.1％,年齡分布范圍大,中青年為主要人群,性別構成比相近。關節(jié)軟骨損傷,常導致關節(jié)疼痛、活動障礙,嚴重者可喪失關節(jié)功能,成為肢體殘障的重要原因[2-4]。目前臨床上常用且較有效治療軟骨損傷的方法是關節(jié)鏡下微骨折術,通過刺激骨髓間充質干細胞(BMSCs)生成來修復

2、軟骨,且修復結果多為纖維組織,其抗壓能力較正常軟骨差;組織工程方法治療費用昂貴、周期長,難以廣泛應用,因此,軟骨修復目前仍是臨床最棘手的難題。我們前期研究中將微骨折術結合關節(jié)腔內沖擊波修復兔股骨遠端軟骨缺損,結果顯示有類透明軟骨形成,明顯優(yōu)于單純微骨折術[5]。但對沖擊波修復軟骨損傷的機理尚不清楚。實驗室研究表明, rESWT對軟骨損傷有修復作用[6]。臨床研究表明,rESWT對肱骨外上髁炎、岡上肌鈣化、跟腱炎、軟組織損傷、慢性疼痛的緩

3、解等具有肯定效果[7]。rESWT的臨床應用過程中,存在影響指標多而雜,缺乏一個統(tǒng)一的指標來衡量和評價其作用效果。在臨床應用過程中,會面對很多不同的疾病,具體使用何種沖擊波探頭、多大的壓力和頻率進行對癥治療才能達到最佳效果,國內外一直都沒有相關研究來解決這個問題[8]。
　　【研究目的】探索衡量rESWT作用效果的統(tǒng)一指標,初步研究rESWT刺激軟骨細胞和軟骨前體細胞的生物學效應,為進一步探索rESWT修復軟骨損傷的最佳方法提供實

4、驗依據。
　　【材料與方法】采用發(fā)散式沖擊波儀器測試直徑為15mm和6mm兩個標準探頭,觀察兩個探頭在不同壓力、頻率變化時的輸出能量(EFD)的變化規(guī)律。使用紋影成像系統(tǒng),觀察36mm平面狀沖擊頭、15mm標準治療頭、10mm標準治療頭、15mm長形治療探頭,在壓力為2×105 Pa,3×105 Pa,4×105 Pa,頻率為10Hz時,使用高速數據采集儀觀察發(fā)散式沖擊波儀器輸出波形。觀察rESWT不同的探頭在不同工作壓力時,在空

5、氣中沖擊波的傳播形態(tài)和作用距離。
　　我們使用新西蘭大白兔膝關節(jié)軟骨分離培養(yǎng)出軟骨細胞和軟骨前體細胞,經過培養(yǎng)傳代至P2代,使用rESWT對其進行刺激,壓力分組0.8×105 Pa,1.5×105 Pa,2.5×105 Pa,3.5×105 Pa,頻率10Hz,沖擊600次。觀察兩種細胞在rESWT刺激后24h時增殖情況差異,使用增殖活性最高的實驗分組的壓力刺激進行下步實驗。組化染色觀察 rESWT刺激細胞后三系分化情況, Q-P

6、CR測試兩種細胞在rESWT刺激后的細胞內軟骨分化相關mRNA水平的變化。
　　【結果】在測量rESWT輸出能量時發(fā)現,相同的頻率時,不同壓力對輸出能量的影響具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。使用相同的壓力下,不同頻率對輸出能量的影響有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。較小壓力時(0.5×105 Pa、1.0×105 Pa)隨著頻率的增加,單個脈沖的能量隨著上升;壓力逐漸增加時(2.0×105 Pa、3.5×105 Pa)隨著頻率的增加單

7、個脈沖的能量是逐漸下降的。隨著壓力的增加,每個頻率的單個脈沖的能量都是增加的,頻率越高時其增加的幅度變小。隨著工作壓力的增加,同一沖擊波探頭的作用距離也隨著增加。空氣中沖擊波作用距離從遠到近依次為,36mm平面狀探頭>15mm長形治療探頭>10mm標準治療頭>15mm標準治療頭。15mm長探頭與15mm標準探頭相比,具有更遠的作用距離和更大角度的作用范圍。
　　rESWT刺激軟骨細胞和軟骨前體細胞后24h,CCK-8法測試細胞增殖

8、活性,結果表明刺激后兩種細胞的增殖活性均增加(P<0.05),軟骨前體細胞比軟骨細胞具有更強的增殖活性(P<0.05)。組化染色結果可以看到,軟骨細胞分化能力不明顯,軟骨前體細胞在沖擊波刺激和誘導之后,具有較強的分化能力。Q-PCR測試細胞內軟骨相關 mRNA表達情況的結果顯示,無論是否進行軟骨分化誘導,1.5×105 Pa組的rESWT刺激均能上調軟骨分化相關基因的表達水平(P<0.05),且軟骨前體細胞比軟骨細胞表達相關基因水平更高