樺褐孔菌菌核形成關鍵酶漆酶基因的克隆與序列分析.pdf

1、樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種十分珍稀的藥用真菌，其主要藥用部位為菌核。為從分子水平研究菌核形成機制，以期為其工廠化栽培提供理論依據(jù)，本文作為前期研究克隆了包括9株樺褐孔菌菌株與2株同屬菌株在內的共11株纖孔菌屬真菌的漆酶編碼基因的DNA片段，同時克隆了菌株 FL的漆酶基因cDNA片段，確定了內含子位置并推導出氨基酸序列，進一步對所得所有序列進行了生物信息學分析。結果如下：
　　1.采用改良CTAB法提取了1

2、1個真菌菌株的高質量基因組DNA，隨后以其為模板，通過漆酶保守結構域設計簡并引物Cu1F和Cu2R，PCR擴增得到11個菌株的一共18個250 bp左右的漆酶編碼基因序列。
　　2.在液體培養(yǎng)下條件下經(jīng)3,5-二羥基甲苯和鄰苯二胺誘導的菌株 FL菌絲體，采用TRIzol法提取其總RNA，經(jīng)反轉錄合成cDNA，并以其為模板通過簡并引物Cu1F和Cu2R擴增得到FL菌株漆酶基因的2個cDNA序列，大小分別為142 bp和148 bp。

3、
　　3.比對得到的各菌株DNA序列與FL菌株的cDNA序列，結果表明各菌株的漆酶基因DNA序列均含有2個內含子，內含子位置保守。比對結果同時將相似度很高的基因序列分為兩個組，命名為Lac1和Lac2，其余相似度較低的序列以“菌株名稱”加“Lac”或“Lac_Un”進行命名，這些基因屬于同一基因家族。此外，Lac1與Lac2中分別有多個菌株序列達到完全一致。
　　4.根據(jù)扣除內含子的各序列推導氨基酸序列，結果表明除NBRC9

4、788編碼46個氨基酸外，其余每個序列均可編碼47個氨基酸。比對氨基酸序列，可以看到兩端的保守序列，該保守區(qū)含有與銅離子結合的三個組氨酸（His/H）。Lac1及Lac2所對應氨基酸序列在組內高度一致，表現(xiàn)出了該基因表達水平上的保守。
　　5.分別基于DNA序列與推導的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化NJ樹，結果顯示ELS菌株與其他菌株有相對較遠的遺傳關系，同時結合菌株中各個漆酶家族基因出現(xiàn)與否——ELS菌株未出現(xiàn)Lac1或Lac2，表明E