抗乙型肝炎病毒核酸藥物的篩選與驗證.pdf

1、　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染及其相關疾病嚴重影響人類健康,同時也使患者家庭及社會承受著巨大的經(jīng)濟負擔。目前針對 HBV 感染仍未找到可以根治的藥物。當前臨床上廣泛使用的抗 HBV 感染藥物包括干擾素和核苷類似物,但是這兩類藥物都存在不同程度的副作用并且均不能徹底清除患者體內的HBV,尤其對HBV表面抗原(hepatitis B surface protein,HBsAg)的清除作用微弱,而 HBsA

2、g的表達是造成 HBV免疫耐受的關鍵因素之一[1],因此尋找能夠抑制HBsAg的藥物將是未來抗HBV治療的重中之重。
　　以生物技術藥物為主要手段的抗 HBV治療是當前研究熱點之一,如DNA疫苗、核酶、反義核酸、RNA 干擾(RNA interference,RNAi)、抗體藥物和Dominant negative突變體(DN突變體)等。本研究就核酸技術在抗 HBV感染中的應用進行探討：
　　目的：研究靶向c-Raf-1

3、基因反義核酸和CpG-ODN 1826體內外抗HBV的活性,并對其作用機制進行初步的探討。
　　方法：1. 通過 HepG2.2.15 細胞瞬時轉染反義核酸藥物,在細胞水平驗證靶向c-Raf-1基因的反義核酸藥物是否具有抗HBV活性；通過細胞活性檢測反義核酸的毒性；通過RT-PCR檢測c-Raf-1基因mRNA水平的變化；通過HBV小鼠水動力模型驗證反義核酸藥物 Raf-3145體內是否具有抗HBV活性； 2. 通過HBV小鼠水

4、動力模型體內評價 CT102是否對 HBV復制具有抑制作用,并檢測 CT102是否對干擾素-α和干擾素-γ的表達具有誘導作用；3. 通過HBV小鼠水動力模型體內評價CpG-ODN 1826對HBV復制的抑制效果,并通過對小鼠血清中干擾素-α和干擾素-γ的檢測驗證CpG-ODN 1826對兩者的強誘導作用。
　　結果：1. 經(jīng)體外篩選,靶向c-Raf-1基因的反義核酸Raf-3145具有相對明顯的抑制 HBsAg的作用,mRNA水

5、平結果顯示 Raf-3145可劑量依賴性的抑制c-Raf-1基因的表達；體內藥效學結果顯示反義核酸 Raf-3145在30 mg/kg劑量下對HBsAg的表達具有一定的抑制作用,并呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.001),并且在該劑量下未見明顯的毒性； 2. 體內藥效學結果顯示CT102在腹腔注射隔天給藥12次第28天檢測時高劑量30 mg/kg可完全抑制表面抗原的表達,并呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.001),中劑量10 mg/kg和低劑量 3 m

6、g/kg時呈現(xiàn)一定促進作用(p<0.01)；檢測血清中干擾素分泌結果顯示在30 mg/kg劑量下CT102對干擾素-α和干擾素-γ具有一定誘導作用； 3. 經(jīng)體內驗證,在腹腔注射隔天給藥12 次第 28 天后發(fā)現(xiàn),CpG-ODN 1826 對血清 HBsAg 和 e 抗原的表達、肝內HBV DNA的復制和肝內HBV核心抗原(HBcAg)的表達均具有明顯的抑制作用并呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應；血清中干擾素檢測結果顯示不同劑量的CpG-ODN

7、1826對干擾素-α和干擾素-γ均具有一定誘導作用。
　　結論：1. 經(jīng)體內外活性評價初步確定了靶向宿主基因 c-Raf-1的反義核酸Raf-3145具有一定的抑制HBsAg表達的活性,也進一步驗證了c-Raf-1基因可以作為抗HBV藥物設計的候選靶點；2. CT102的抗HBV效果可能與其干擾素誘導作用相關；3. 小鼠強效免疫刺激劑CpG-ODN 1826可以有效抑制HBV的復制,尤其對 HBsAg 的清除作用明顯,是當前干擾