苦瓜枯萎病菌的鑒定、遺傳多樣性及其與寄主互作差異蛋白研究.pdf

1、苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；停‵usarium oxysporum Schl.f.sp.momordicae Sun&Huang）侵染引起的一種植物土傳病害，遍及中國、菲律賓、日本以及印度等亞洲國家的苦瓜主產(chǎn)區(qū)，嚴重制約了當?shù)乜喙袭a(chǎn)業(yè)發(fā)展。本研究對尖孢鐮刀菌苦瓜?；筒≡蔫b定、分子檢測、遺傳多樣性、種質(zhì)資源抗性的苗期鑒定以及病原菌與寄主互作的差異蛋白質(zhì)分析等方面進行研究，獲主要結(jié)果如下:
　　1、2009～2010年從我

2、國6個省份采集苦瓜枯萎病標樣分離的菌株，根據(jù)病菌形態(tài)特征、致病性和rDNA-ITS序列測定的結(jié)果，將48株菌株鑒定為尖孢鐮刀菌苦瓜?；?。不同菌株對苦瓜幼苗的致病力存在差異，菌株的致病力強弱與菌落產(chǎn)生的色素無關(guān)。測試的菌株除侵染苦瓜的幼苗外，還可以侵染蒲瓜、園扁葫蘆和長頸葫蘆等瓠瓜變種的幼苗，但不侵染瓠瓜變種細腰葫蘆及其他瓜類的幼苗。在rDNA-ITS序列聚類樹中，48株自測的苦瓜枯萎病菌株與來自GenBank數(shù)據(jù)庫中的13株尖孢鐮刀菌

3、菌株聚成一群，與其他鐮刀菌菌株分在不同進化枝上，但rDNA-ITS序列不能把尖孢鐮刀菌苦瓜專化型菌株與種內(nèi)的其他?；途陞^(qū)分成不同類群。
　　2.用320條隨機引物對不同地理來源的24株瓜類枯萎病菌的基因組DNA進行RAPD-PCR擴增和圖譜特征分析，獲得大小為519bp的尖孢鐮刀菌苦瓜?；途晏禺惖钠蜸58-519，經(jīng)回收純化和克隆測序，設計出一對特異引物F1/R1，成功將目標RAPD標記轉(zhuǎn)換成SCAR標記RS-256。驗

4、證實驗結(jié)果表明，該標記表現(xiàn)出穩(wěn)定的特異性和專一性，設計的特異引物可以直接用來鑒別尖孢鐮刀菌苦瓜?；途?，不需要進行寄主回接試驗。建立了尖孢鐮刀菌苦瓜?；途甑腟CAR-PCR檢測體系，該體系能檢測到濃度為1 pg·μL-1的病原菌基因組DNA、土壤中100個病原孢子·g-1和已感病但未顯癥的苦瓜植株組織中的苦瓜枯萎病菌。
　　3、用18條RAPD標記多態(tài)性隨機引物分析48株尖孢鐮刀菌瓜類專化型菌株的遺傳多樣性，標記出的DNA條

5、帶多態(tài)性檢測率平均為97.81％，平均每個引物產(chǎn)生14.5條多態(tài)性條帶;在尖孢鐮刀菌瓜類?；途甑腞APD分析聚類樹狀圖中，所有苦瓜枯萎病菌株聚在一個分支上（G1群），菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.92～1.00，具有較高的遺傳相似性，且菌株的聚群與地理來源存在一定的相關(guān)性。用7對AFLP標記多態(tài)性豐富的EcoRI-MseI選擇性擴增引物分析48株不同地理來源的尖孢鐮刀菌苦瓜?；途甑倪z傳多樣性，擴增位點的多態(tài)率平均為99.14％，

6、單對引物擴增的多態(tài)位點平均為51.86個;在尖孢鐮刀菌苦瓜?；途甑腁FLP分析聚類樹狀圖中，菌株聚群與菌株致病力存在一定相關(guān)性，其中高毒力菌株聚在AG1群，遺傳相似系數(shù)為0.91～0.99，其他相對低毒力的菌株分別聚在11個分支上，遺傳差異顯著;高毒力菌株的聚群與菌株的地理來源高度相關(guān);利用PopGene軟件分析6個苦瓜枯萎病菌地理居群間的遺傳分化程度，發(fā)現(xiàn)居群間的相似程度較低，遺傳距離較大，菌株的遺傳分化主要發(fā)生在居群間，菌株居群

7、間的基因交換較少，表明苦瓜枯萎病菌株的遺傳多樣性程度高。
　　4.用苗期浸根接種法對143份苦瓜高代自交系材料進行抗枯萎病鑒定，發(fā)現(xiàn)苦瓜種質(zhì)資源對枯萎病菌株AS-1的抗性反應主要集中在高感和感病類型;8份抗病材料均來自中國，抗病種質(zhì)資源的果實性狀主要表現(xiàn)為短棒形、皮色淺綠、瓜瘤為條瘤和條粒瘤;東南亞國家及日本的苦瓜種質(zhì)資源中沒有表現(xiàn)抗性的材料。
　　5.應用雙向電泳技術(shù)研究苦瓜抗枯萎病材料MC1-1-1和感枯萎病材料MC1-

8、1的根系在病菌脅迫下的蛋白質(zhì)差異表達情況。與對照組比較，接菌后根系蛋白質(zhì)豐度變化差異量達150％以上的蛋白點有25個，其中苦瓜感枯萎病材料MC1-1有12個差異蛋白質(zhì)點表達量上調(diào)，3個表達量下調(diào);苦瓜抗枯萎病材料MC1-1-1有4個差異蛋白質(zhì)點表達量上調(diào)，6個表達量下調(diào)。用MALDI-TOF-TOF/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定了其中22個蛋白點，將蛋白點的肽指紋圖譜測定結(jié)果通過MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索比對，成功鑒定出17個蛋白點，其中參與細胞防御或