導向性IFN-α2a-α-MSH基因的克隆、融合蛋白的表達、純化及生物學活性的測定.pdf

1、目的：IFN-α2a是一種具有抗病毒、免疫調節(jié)和抗腫瘤活性等多種生物功能的細胞因子，已被FDA批準用于多種病毒性疾病和惡性腫瘤的治療。但IFN-α2a在臨床治療中需大劑量長期給藥，并且常常引發(fā)明顯的毒副作用，嚴重制約著IFN-α2a的臨床應用。 Α-MSH（SYSMEHFRWGKPV）是一種由多種細胞分泌的含13肽激素，是一種天然存在的多肽，可特異性的與黑素細胞及惡性黑色素瘤細胞表面的MC-1R結合，促進惡性黑色素瘤細胞的凋亡，

2、并可通過皮膚基底膜的重建抑制皮膚惡性黑色素瘤的轉移。研究表明所有黑素細胞和黑素瘤細胞都表達α-MSH受體MC-1R，且黑素瘤細胞表達MC-1R上調，人黑素瘤細胞表面MC-1R密度為900-5700個結合位點/每細胞，而正常狀態(tài)下人表皮黑素細胞上MC-1R不超過100個結合位點/每細胞。本課題擬利用基因重組技術，構建導向性IFN-α2a-α-MSH融合基因表達載體，并在大腸桿菌中表達，制備一種治療惡性黑色素瘤的靶向制劑。 方法：將

3、本實驗室已構建的pET-22b(+)IFN-α2a-NGR用BamH I和Sal I限制性內切酶進行雙酶切，將得到的大片段與設計的α-MSH多肽片段退火后的產物進行連接，構建原核表達載體pET-22b(+)IFN-α2a-α-MSH，將序列鑒定正確的重組質粒轉化入Rosetta-gamiTM2(DE3)大腸桿菌，IPTG誘導目的蛋白表達。對表達產物進行SDS-PAGE及Western Blot鑒定，疏水作用層析純化蛋白。 建立小

4、鼠惡性黑色素瘤模型，用得到的IFN-α2a-α-MSH蛋白對惡性黑色素瘤小鼠進行治療，觀察腫瘤體積變化，計算抑瘤率，并進行統(tǒng)計學分析。 結果：在大腸桿菌中成功實現了IFN-α2a-α-MSH的穩(wěn)定、高效表達，表達產物以包涵體形式存在，采用超聲裂菌的方法，用疏水作用層析技術獲得較高純度的重組蛋白。抑瘤實驗結果顯示IFN-α2a-α-MSH的抑瘤率明顯高于IFN-α2a和對照組。 結論：成功構建了pET-22b(+)IFN-