人精子蛋白FSCB的基因克隆、表達(dá)和生物學(xué)特性的初步研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的受精過程是一系列的復(fù)雜事件。首先精子必須有正常的運(yùn)動(dòng)能力,這種能力保證受精過程中精卵相遇,也參與精子對(duì)卵的機(jī)械穿透作用。此外,哺乳動(dòng)物精子必須在雌性生殖道內(nèi)經(jīng)歷成熟過程發(fā)生生理及形態(tài)學(xué)的變化才能獲得受精能力,這一現(xiàn)象稱為獲能。精子獲能是精子頂體反應(yīng)和受精的一個(gè)重要生理前提。
　　 與精子獲能相關(guān)的蛋白較多,包括SP-10,FA-1,YLP-12,CABYR等。本文所研究的目的蛋白FSCB(Fibrous Sheath

2、Cabyr-Binding,FSCB)是本單位李彥鋒博士于2007年發(fā)現(xiàn)的定位于鼠精子尾部纖維鞘的一種蛋白,可與CABYR蛋白相結(jié)合,因此得名。目前研究認(rèn)為FSCB蛋白可能是調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)和獲能的一種重要蛋白。結(jié)合對(duì)鼠精子的初步研究結(jié)果,我們對(duì)其人同源基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示該人同源基因序列位于14號(hào)染色體,全長(zhǎng)序列已公布于GenBank數(shù)據(jù)庫。
　　 到目前為止,尚沒有任何對(duì)人FSCB蛋白進(jìn)行研究的報(bào)告。鑒于同源鼠精子

3、FSCB可能在精子運(yùn)動(dòng)和獲能中的重要作用,對(duì)人FSCB蛋白的生物學(xué)特性和相關(guān)作用進(jìn)行深入研究是非常有意義的。
　　 本研究通過PCR擴(kuò)增人FSCB基因編碼序列,通過基因重組技術(shù)將其插入質(zhì)粒pET32a(+)和pET28b(+)中,構(gòu)建重組表達(dá)載體和重組菌株,分離純化蛋白后免疫動(dòng)物成功制備了多克隆抗體,進(jìn)行該蛋白生物學(xué)特性的初步研究。本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1.人FSCB基因的克隆和測(cè)序:根據(jù)該FSCB蛋白的理

4、論基因序列,設(shè)計(jì)帶適當(dāng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物,以人睪丸marathon-ready cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得全長(zhǎng)序列FSCB和部分截短(truncated)序列FSCBt。測(cè)序結(jié)果與GenBank公布序列一致。
　　 2.重組人FSCB蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá):FSCB及FSCBt基因分別與線性化pMD18-T載體相連接,在大腸桿菌DH5a中擴(kuò)增后,獲得NcoⅠ/HindⅢ雙酶切片段,將其插入到表達(dá)載體pET3

5、2a(+)和pET28b(+)中,應(yīng)用大腸桿菌BL21菌株在1mmol/L IPTG,30℃條件下成功進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并通過抗His抗體檢測(cè),重組蛋白FSCB和FSCBt的表觀分子量分別約為230KDa和30KDa,均大于其理論分子量。
　　 3.重組人FSCBt蛋白的分離純化及抗人FSCB多克隆抗體的制備:因表達(dá)載體均帶His標(biāo)簽,通過NP2+柱進(jìn)行初純化,再通過分子篩層析進(jìn)行第二步純化,獲得95％純度重組FSCBt蛋白。根據(jù)標(biāo)

6、準(zhǔn)的重組蛋白免疫動(dòng)物制備抗體的方案,以純化后重組FSCBt加弗氏佐劑免疫雌性家兔,間隔2周加強(qiáng)免疫一次,共4次,2月后獲得效價(jià)達(dá)1:105多克隆抗體。經(jīng)Western blot檢測(cè)可特異性識(shí)別重組蛋白FSCB和FSCBt。
　　 4.人FSCB蛋白表達(dá)的組織特異性分析:以所獲得的多克隆抗體通過Western blot檢測(cè)人體正常心、肺、胰、脾、肌肉和睪丸組織蛋白表達(dá)情況,確定該蛋白僅在睪丸組織內(nèi)有表達(dá)。
　　 5.免疫組

7、化結(jié)果顯示:抗FSCB多克隆抗體可使睪丸組織內(nèi)精子和部分精細(xì)胞著色,說明精子和精細(xì)胞內(nèi)有FSCB表達(dá)。
　　 6.人FSCB蛋白在精子上定位的初步研究:取正常精液標(biāo)本通過間接免疫熒光法檢測(cè),觀察到該蛋白定位于成熟精子尾部的主段。
　　 綜上所述,本研究通過基因工程方法,原核表達(dá)了重組人FSCB蛋白,成功制備特異性的抗FSCB多克隆抗體,檢測(cè)到人FSCB在精子尾部的表達(dá),具有睪丸特異性。這為進(jìn)一步研究FSCB蛋白在精子運(yùn)動(dòng)