人B7-H4-Fc融合蛋白的制備及B7-H4受體表達的檢測.pdf

1、B7-H4分子是近年新發(fā)現(xiàn)的一個B7家族成員，其與受體結合后通過抑制ERK、JNK、p38、AKT等分子的活性，進而抑制T細胞的增殖、活化和細胞因子的產生，發(fā)揮其負性調節(jié)的作用。人B7-H4分子定位于人染色體1p11.1，由6個外顯子和5個內含子組成，其mRNA在淋巴和非淋巴組織中呈廣泛性表達，但由于受到轉錄后水平的嚴格調控，B7-H4蛋白僅在正常組織中呈現(xiàn)微弱的表達。近來的研究表明，B7-H4分子在正常人新鮮分離的 T、B淋巴細胞、單

2、核細胞和樹突狀細胞（DCs）表面均無表達，但可以被體外活化刺激因子誘導表達，研究還發(fā)現(xiàn)，B7-H4分子在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤細胞以及腫瘤相關巨噬細胞中異常高表達。這些證據都表明在腫瘤微環(huán)境中 B7-H4的表達對腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視具有重要作用。目前，B7-H4分子的受體還未發(fā)現(xiàn)，但關于其受體的研究是目前免疫學研究的熱點之一，其受體的發(fā)現(xiàn)將會對幫助我們更進一步的了解B7-H4分子的作用機制，為臨床應用提供一定的理論依據

3、。
　　本研究旨在通過構建 B7-H4-Fc融合蛋白的真核表達體系，獲得高純度的B7-H4-Fc融合蛋白，利用免疫沉淀法分離B7-H4受體，并利用熒光標記的B7-H4-Fc融合蛋白檢測B7-H4受體在不同臨床標本中的表達。
　　一、人B7-H4-Fc融合蛋白的表達及其應用研究
　　【目的】體外克隆擴增人B7-H4分子的胞外段基因以及人Fc段基因，將其重組至pEGZ–Term真核表達載體，構建表達人B7-H4-Fc融合蛋

4、白的基因轉染細胞株并初步研究B7-H4-Fc融合蛋白的生物學功能。
　　【方法】通過PCR的方法體外擴增人B7-H4分子的胞外段基因和人Fc段基因，并分別克隆入T載體中，雙酶切后裝入逆轉錄病毒載體pEGZ–Term中，構建重組真核表達載體pEGZ–Term/B7-H4-Fc并進行鑒定；與輔助病毒載體用脂質體法共轉染包裝細胞293T制備含有重組病毒的培養(yǎng)上清，以其培養(yǎng)上清感染CHO細胞，經Zeocin篩選出穩(wěn)定表達B7-H4-Fc融

5、合蛋白的CHO細胞株；通過流式細胞術和Western Blot檢測CHO/B7-H4-Fc轉基因細胞株是否構建成功，純化鑒定B7-H4-Fc融合蛋白并對其生物學功能進行初步研究。
　　【結果】成功構建了pEGZ–Term/B7-H4-Fc重組真核表達載體，篩選并鑒定獲得能穩(wěn)定高表達人B7-H4-Fc融合蛋白的轉基因細胞并分離純化出了該融合蛋白，初步檢測該融合蛋白具有體外抑制T細胞增殖的作用，并利用該融合蛋白成功的分離純化出了B7-

6、H4受體。
　　【結論】成功的構建了能穩(wěn)定表達B7-H4-Fc融合蛋白的轉基因細胞株，并分離純化出B7-H4-Fc融合蛋白，為進一步研究B7-H4分子的生物學功能奠定基礎。利用免疫沉淀的方法，分離出了B7-H4受體分子。
　　二、檢測B7-H4未知受體的表達
　　【目的】利用熒光標記的B7-H4-Fc融合蛋白，檢測B7-H4受體在多種細胞表面的表達。
　　【方法】以本研究獲得的B7-H4-Fc融合蛋白為基礎，對其

7、進行異硫氰酸熒光素（FITC）熒光標記，利用FITC標記的B7-H4-Fc蛋白作為配體，流式細胞術檢測多種不同來源的淋巴細胞上B7-H4受體的表達。
　　【結果】檢測分析發(fā)現(xiàn)在來源于扁桃體的部分B淋巴細胞上組成性的表達B7-H4受體，在活化T細胞和肺癌組織、肺癌轉移淋巴結來源的T細胞也表達B7-H4受體。
　　【結論】檢測到組成性表達B7-H4受體的B淋巴細胞使我們提取B7-H4受體蛋白進行進一步的研究成為可能。B7-H4受