淀粉樣蛋白(Aβ)突變體的制備、性質(zhì)及其神經(jīng)細胞毒性機制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是德國學(xué)者Alois Alzheimer于1907年首次報道的一種常發(fā)于老年人當(dāng)中的神經(jīng)退行性疾病。全世界大約有3000萬人患有阿爾茨海默病，并且患病人數(shù)正在逐年增加，嚴(yán)重威脅到人類的健康。AD患者的主要臨床表現(xiàn)為不同程度的記憶力喪失、認知能力降低、語言功能喪失、行為和感情活動異常。AD的病理特征包括神經(jīng)元數(shù)量減少，顆?？张葑冃?、淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)。AD的發(fā)病原因十分復(fù)雜

2、，可能是多種因素相互作用的結(jié)果，迄今為止，其確切的發(fā)病機理還是一個未解之謎。
　　淀粉樣蛋白Aβ(amyloid beta peptide)是AD患者腦中老年斑(senile plaques，SP)的主要組成成分，在AD的發(fā)病機制的研究中占據(jù)著中心地位。在AD患者的腦內(nèi)，Aβ由淀粉樣前體蛋白APP(amyloid precursor protein，APP)酶切產(chǎn)生，釋放進入突觸，與同樣釋放進入突觸中的游離狀態(tài)的Cu2+，Zn2+

3、等金屬離子發(fā)生作用。在AD病人腦中，金屬離子(Cu2+，Zn2+)能夠誘導(dǎo)Aβ聚集，同時促進自由基的產(chǎn)生，進一步加劇細胞毒性。與人淀粉樣蛋白(human amyloid beta, hAβ)的氨基酸序列相比，鼠淀粉樣蛋白(mouse amyloid beta, mAβ)的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)了三個位點的氨基酸突變，即第五位的精氨酸變成了甘氨酸(R5G)，第十位的酪氨酸變成了苯丙氨酸(Y10F)和第十三位的組氨酸變成了精氨酸(H13R)。成年鼠

4、類的大腦中沒有發(fā)現(xiàn)老年斑，可能與這三個位點的氨基酸密切相關(guān)。研究表明，Y10F-Aβ1-40的神經(jīng)細胞毒性比野生型Aβ1-40弱，表明Aβ中第10位的酪氨酸在Aβ的神經(jīng)細胞毒性中發(fā)揮著重要的作用。除了Aβ在腦中的聚集以外，AD的細胞病理學(xué)特征還包括血紅素代謝紊亂。體外實驗表明化學(xué)合成的Aβ通過Arg5和Hisl13與血紅素結(jié)合后形成具有過氧化物酶活性復(fù)合物。通過比較mAβ和hAβ的性質(zhì)和神經(jīng)細胞毒性的差異，我們試圖了解成年鼠大腦中沒有淀

5、粉樣斑塊的原因及其相關(guān)分子機制。通過原核表達系統(tǒng)獲得了mAβ和hAβ，我們通過圓二色譜，硫磺素?zé)晒夤庾V，ANS熒光光譜和透射電鏡檢測了mAβ和hAβ的聚集情況。細胞層次上使用熒光探針檢測了ROS產(chǎn)生情況，同時測定了細胞活性。我們還監(jiān)測了mAβ和hAβ與Heme的結(jié)合以及形成的復(fù)合物的過氧化物酶活性。實驗結(jié)果表明，相對于hAβ而言，mAβ聚集生成淀粉樣纖維的能力較弱和疏水能力都較小。透射電鏡顯示，mAβ聚集形成稀少狹長的纖維。mAβ的神經(jīng)

6、細胞毒性更低，可能的原因為mAβ誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的ROS更少。相對于hAβ與Heme形成的復(fù)合物，mAβ與Heme形成的復(fù)合物在412nm處沒有特征吸收峰，過氧化物酶活性較低。我們推測，鼠大腦中沒有淀粉樣斑塊的原因為mAβ聚集形成纖維的能力弱和神經(jīng)細胞的毒性低。
　　現(xiàn)在已知Aβ在某些人群中具有基因突變的現(xiàn)象，這些突變會導(dǎo)致人群中早發(fā)性AD。與野生型的人淀粉樣蛋白氨基酸序列相比，部分荷蘭人中第22位的谷酸胺變成了谷氨酰胺(E22Q)，

7、部分大阪人中第22位的谷氨酸缺失(△E22)。我們采用分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得了高純度的E22Q-Aβ1-42和△E22Aβ1-42。通過圓二色譜，硫磺素?zé)晒夤庾V，ANS熒光光譜和透射電鏡檢測了E22Q-Aβ1-42和△E22Aβ1-42的聚集情況。細胞層次上使用熒光探針檢測了ROS產(chǎn)生情況，同時測定了細胞活性。實驗結(jié)果表明，相對于hAβ1-42而言，E22Q-Aβ1-42和△E22 Aβ1-42聚集生成淀粉樣纖維的能力和疏水能力

8、都變?nèi)?。E22Q-Aβ1-42和△E22Aβ1-42的神經(jīng)細胞毒性比野生型Aβ1-42更高，可能的原因為E22Q-Aβ1-42和△E22Aβ1-42誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的更多ROS。
　　小角X射線散射可以用來測量顆粒大小為1-100 nm的粒子的分布，而Aβ聚集后，其顆粒粒徑恰好在這個范圍。因此，我們采用小角X射線散射研究了Aβ的顆粒隨時間的分布情況。實驗結(jié)果表明，隨著時間的增加，Aβ逐漸聚集，旋轉(zhuǎn)半徑逐漸增大。加入金屬離子(Cu2+和