CD147與CAML在惡性黑素瘤細胞中的相互作用研究.pdf

1、研究目的:
　　CD147是一種屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，本實驗組前期研究表明CD147能促進惡性黑素瘤侵襲、轉移、增殖和血管新生，但具體機制還不十分清楚。鈣離子信號調節(jié)親環(huán)素配體（calcium-modulatingcyclophilinligand，CAML）是定位于線粒體的跨膜蛋白，能調節(jié)胞內鈣離子濃度，本研究擬通過對CD147與CAML在惡性黑素瘤細胞株A375中相互作用的研究，明確其相互作用的位點，在細胞中的定位

2、及對胞內鈣離子的影響，為進一步揭示惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論依據。
　　研究方法:
　　1.以CD147為誘餌，運用酵母雙雜交技術篩選人胚腦細胞文庫，以尋求與其相互作用的蛋白。
　　2.構建CAML與CD147全長及缺失突變體的真核表達載體。
　　3.運用免疫共沉淀(co-IP)驗證CD147與CAML相互結合，同時共轉染CAML質粒及CD147的不同缺失突變體質粒至工具細胞293T，co-IP分析CD

3、147與CAML相互結合的位點。
　　4.運用細胞免疫熒光方法觀察A375細胞中CD147與CAML的定位，同時在A375細胞中共轉染CAML及CD147的不同缺失突變體質粒，檢測不同區(qū)段對定位的影響。
　　5.合成CD147的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA，iRNA)片段，利用該片段在A375細胞中敲降CD147并檢測敲降效率。
　　6.運用Fluo-4，AM探針觀察CD147敲降對A375

4、細胞內靜息鈣離子濃度的影響，以及毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)抑制內質網鈣離子ATP酶(Sarco/EndoplasmicreticulumCa2+-ATPase，SERCA)后對胞內鈣離子流動的影響。
　　7.運用佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)和TG上升A375細胞胞內鈣離子，檢測基質金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9，MMP-9)的表達水平

5、，同時檢測CD147敲降的A375細胞在上述兩種藥物作用后的MMP-9表達水平的變化。
　　研究結果:
　　1.酵母雙雜交篩選出CAML與CD147相互作用。
　　2.成功構建了CAML與CD147全長及缺失突變體的真核表達載體。
　　3.Co-IP驗證CAML與CD147相互作用的結果，并進一步證實CD147與CAML相互結合的區(qū)段位于CD147跨膜段。
　　4.細胞免疫熒光發(fā)現A375細胞中CD147與

6、CAML在內質網存在共定位現象，缺失跨膜及膜內段的CD147突變體與CAML幾乎不存在共定位。
　　5.成功設計并應用兩個CD147siRNA片段，以無特異性siRNA序列為對照組。
　　6.CD147敲降的A375細胞內靜息鈣離子濃度及TG刺激胞漿內鈣離子上升幅度均低于對照組。
　　7.PMA及TG上升胞內鈣離子后能誘導MMP-9的表達增加，而敲降CD147則能顯著抑制鈣離子對MMP-9的誘導效應。
　　結論：