StAR對軟脂酸導致的內皮細胞功能障礙的保護作用研究.pdf

1、類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)是膽固醇的一種轉運蛋白，主要參與膽固醇代謝，合成類固醇激素。本課題組前期研究表明StAR表達于肝臟、血管內皮細胞及巨噬細胞中，具有在線粒體內外膜間轉運膽固醇、調節(jié)膽固醇代謝的作用。
　　血管內皮除了維持血管壁完整外，還具有重要的穩(wěn)態(tài)調節(jié)功能:首先，內皮細胞通過其生成并釋放的一氧化氮(NO)、緩激肽、內皮素、前列環(huán)素調

2、節(jié)血管張力;其次，內皮細胞通過相關血管活性物質抑制炎性細胞、血小板的聚集和粘附，抑制平滑肌的增殖和遷移等。某些內源性和外源性因子導致血管內皮功能異常，包括精神性和生理學應激、動脈粥樣硬化、高血壓、老齡化、炎癥和糖尿病等疾病狀態(tài)，使內皮從穩(wěn)定狀態(tài)變?yōu)槭胶鉅顟B(tài)，即內皮功能發(fā)生異常，又稱內皮功能障礙。內皮功能障礙是動脈粥樣硬化等心血管疾病的始發(fā)環(huán)節(jié)，是由長期暴露于心血管疾病危險因素引起的，其中最主要的危險因素是以高血脂為特征的脂質代謝紊亂，

3、又以循環(huán)血中的高游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）對內皮細胞的損害最為重要，也是目前該領域研究的熱點之一。研究表明，F(xiàn)FA水平增高可損害內皮細胞一氧化氮合酶(eNOS)的活性，抑制內皮細胞依賴性的血管舒張、促進內皮細胞炎癥因子的釋放及誘導細胞的凋亡等。因此，針對FFA導致的內皮功能障礙的相關機制的研究，對于保護內皮細胞功能，進一步預防和治療動脈粥樣硬化具有重要意義。綜上，本課題擬在原代大鼠主動脈內皮細胞中過表達StAR

4、后，研究StAR是否對軟脂酸(palmitic acid，PA)引起的內皮功能障礙具有保護作用。
　　本研究共包括兩部分內容，詳細如下:
　　第一部分:類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白(StAR)對原代大鼠主動脈內皮細胞脂質代謝基因表達的影響
　　我們以大鼠主動脈內皮細胞(Rat aortal endothelial cell，RAEC)為研究對象，首先用動脈環(huán)法成功培養(yǎng)了大鼠主動脈內皮細胞，利用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)

5、學特征;利用細胞免疫化學方法顯示血管內皮細胞特異性表面抗原標志;其次利用攜帶StAR全長cDNA的腺病毒載體轉染培養(yǎng)的內皮細胞，利用實時定量PCR和Wesern blot方法驗證StAR在內皮細胞中過表達，同時檢測轉染后細胞內脂質代謝相關基因的表達變化。結果顯示:動脈環(huán)法培養(yǎng)的大鼠主動脈內皮細胞72小時后自動脈環(huán)中爬出，具有典型血管內皮細胞特征（鋪路石樣、管腔樣形成），CD31、vW因子等內皮細胞特異性標志表達陽性;利用腺病毒Ad-St

6、AR，以不同的感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI=10，20，50，100)轉染RAEC，48小時后提取細胞總RNA及蛋白，StAR的mRNA及蛋白表達隨著病毒感染復數(shù)增加而遞增，結果提示利用腺病毒載體在RAEC中成功過表達StAR。其次，在腺病毒轉染48小時后，與轉染空載體組相比，過表達StAR組FAS、ACC-1、HMGR、LDLR、SREBP-2 mRNA表達明顯降低(P＜0.05);最后，在腺病

7、毒轉染48小時后以氯仿/異丙醇/NP-40及氯仿/TritonⅩ-100分別萃取細胞內膽固醇及游離脂肪酸，利用膽固醇檢測試劑盒（CHO酶法）和游離脂肪酸超敏測定試劑盒檢測細胞內總膽固醇和游離脂肪酸含量，結果顯示:StAR轉染48小時后，與轉染空載體EGFP組相比，過表達StAR組細胞內總膽固醇及游離脂肪酸含量明顯降低（P＜0.05）。
　　第二部分:StAR對PA引起的內皮功能障礙的保護作用。
　　我們以原代培養(yǎng)的大鼠主動脈

8、內皮細胞為研究對象，利用攜帶StAR全長cDNA的腺病毒載體在RAEC中過表達StAR。首先，以外源性PA為刺激因素，腺病毒轉染48小時后加入培養(yǎng)的RAEC中，于不同時間點提取細胞RNA，利用實時定量PCR檢測細胞炎癥因子IL-1β、TNFα、IL-6、VCAM-1的基因表達;利用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子含量;同時收集細胞，分別提取細胞胞漿及胞核蛋白，利用Western blot方法檢測核轉錄因子NFκB在胞漿和胞核中

9、的表達。結果顯示:過表達StAR能抑制PA導致的炎癥因子基因表達增高及釋放增多，其作用機制是通過抑制NFκB的核轉位，從而抑制其活化，最終抑制NFκB下游炎癥因子的轉錄活性，進一步減少炎癥因子釋放。其次，在腺病毒轉染RAEC48小時后加入外源性PA，在不同時間點收集細胞，提取細胞總蛋白，利用Western blot方法檢測p-Akt/p-eNOS信號通路的變化，并利用NO檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中NO的釋放量。結果顯示:PA能抑制p-Ak

10、t/p-eNOS/NO通路，減少NO的生成和釋放，而過表達StAR能明顯減輕PA的抑制作用，增加Akt及eNOS的磷酸化水平，增加RAEC中NO的釋放，維持血管內皮舒縮功能的平衡。
　　綜上所述，本課題首先利用主動脈環(huán)貼壁法成功在體外培養(yǎng)了RAEC，并通過形態(tài)學及細胞表面標志物檢測證實為血管內皮細胞;利用攜帶StAR全長cDNA的腺病毒載體可在RAEC中過表達StAR;過表達StAR可抑制RAEC中的膽固醇和脂肪酸合成關鍵酶的表達