自噬參與低氧后處理對成年大鼠短暫全腦缺血的保護作用.pdf

1、背景與目的：大鼠短暫全腦缺血可引起特定區(qū)域如海馬的神經元發(fā)生延遲死亡。機體在短時間內暴露于非致死性的損傷因素，如非損傷性的缺血、皮層擴布性抑制、短暫性癲癇發(fā)作、麻醉劑吸入、低劑量的脂多糖內毒素等，可減輕后續(xù)的嚴重性、致死性的缺血或缺氧損傷，此為缺血耐受。在致死性的缺血再灌注之后的一定時間內，給予一次或者多次短暫缺血再灌注，使腦組織對致死性的缺血產生耐受，此為腦缺血后處理。作為一種腦缺血后處理的方式，低氧后處理發(fā)揮神經元保護作用的機制尚不

2、清楚。我們先前應用TUNEL法研究結果顯示，成年大鼠tGCI再灌注24小時開始出現神經細胞凋亡，再灌注48小時凋亡細胞增多，再灌注7天凋亡細胞數下降。自噬是否參與短暫全腦缺血所致的神經元損傷，低氧后處理是否通過調節(jié)自噬發(fā)揮神經保護作用，尚不清楚。本研究檢測自噬相關蛋白LC3、LAMP2、Cathepsin D在短暫全腦缺血和短暫全腦缺血-低氧后處理后海馬CA1區(qū)的表達變化，以及觀察電鏡下自噬體的形成，闡明自噬是否參與低氧后處理對短暫全腦

3、缺血的保護作用。
　　材料與方法：選取體重為250-300 g的成年雄性Wistar大鼠。低氧后處理采用在密閉防潮箱內持續(xù)通入8％ O2+92% N2混合氣體。全腦缺血模型采用Pulsinelli經典的四血管阻塞模型。采用電鏡觀察神經元內超微結構的變化及自噬體的形成，采用免疫組化、Western blot檢測自噬相關蛋白LC3、LAMP2、Cathepsin D在短暫全腦缺血和低氧后處理后海馬CA1區(qū)的表達變化。
　　結果：

4、（1）電鏡下 Sham組神經元核膜完整，核內染色體淡染，胞漿可見豐富的粗面內質網和形態(tài)正常的線粒體。tGCI組再灌注26小時，胞漿內線粒體腫脹，并出現少量自噬體，可見部分自噬體內的胞漿成分已降解，呈高電子密度。在再灌注50小時，胞漿內自噬體明顯增多。再灌注7天，細胞器崩解，組織壞死，未見正常的細胞結構。HPC組，細胞結構尚完整，可見胞核、線粒體、溶酶體等細胞器，并見少量的雙層膜自噬體。
　?。?）LC3免疫陽性成分在短暫全腦缺血后

5、，局部聚集，給予低氧后處理，LC3均勻分布至胞漿。Western blot結果顯示，tGCI組LC3-Ⅱ/Ⅰ逐漸升高,在再灌注50小時，達到高峰（p<0.05）。
　?。?）Sham組LAMP2免疫反應陽性細胞在錐體細胞層呈圓形、卵圓形（神經元樣），多形層、分子層的免疫陽性細胞呈梭形、星形（膠質細胞樣）。單純低氧后24小時，神經元樣細胞數明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義，缺血后4小時，神經元樣細胞數一過性增多，至缺血后168小時，低于S

6、ham組水平（p<0.05）。給予tGCI鼠低氧后處理后，神經元樣細胞數在低氧后24小時、6天與對應時間點的tGCI組比較，變化不明顯（p>0.05），低氧后0小時低于對應時間點的tGCI組（p<0.05）。單純低氧后0小時、24小時，膠質細胞樣細胞數無明顯變化（p>0.05）。在再灌注0小時，即開始增多，在再灌注50小時達高峰，并維持至再灌注7天，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。tGCI后給予低氧后處理，低氧后6天膠質細胞樣細胞數

7、較對應時間點的tGCI組增多（p<0.05）。Western blot結果顯示，單純低氧后24小時，LAMP2表達增多（p<0.05）；tGCI后，在再灌注0小時升高。在4小時、26小時、50小時均無明顯變化，在低氧后0小時、24小時，與對應時間點的tGCI組比較，差異無統(tǒng)計學意義。
　　（4） Sham組海馬CA1區(qū)Cathepsin D免疫反應陽性細胞胞體大而圓，分子層突起長而明顯。與 Sham組比較，單純低氧0小時、24小時

8、變化不明顯。在tGCI組，陽性細胞的光密度值在再灌注0小時、50小時、168小時降低，差異均有統(tǒng)計學意義；在再灌注4小時至26小時，維持在Sham水平；tGCI后，給予低氧后處理后24小時、6天，Cathepsin D表達量升高，均恢復至Sham水平，與相應時間點的tGCI組比較，p<0.05。Western blot結果顯示與Sham組比較，單純低氧0小時、24小時略升高，但差異無統(tǒng)計學意義；tGCI后，在再灌注0小時達到高峰，并維持

9、至26小時，在再灌注50小時降低至Sham水平；tGCI后給予低氧后處理，在低氧后0小時，與對應時間點的tGCI組比較，差異無統(tǒng)計學意義，在低氧后24小時，與對應時間點的tGCI組比較，略升高，但差異仍無統(tǒng)計學意義。
　　（5）LAMP2免疫熒光雙標顯示，Sham組 LAMP2主要在小膠質細胞表達，在CA1腹內側主要在神經元胞漿表達。tGCI組再灌注7天，LAMP2主要在小膠質細胞表達。
　　結論：（1）自噬在短暫全腦缺血后