ERβ水平影響他莫昔芬抗乳腺癌細(xì)胞作用的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景：乳腺癌是危害婦女健康的最主要惡性腫瘤之一,據(jù)統(tǒng)計(jì)每年全球范圍內(nèi)大約有120萬婦女罹患乳腺癌,超過50萬人死于乳腺癌。在西歐、北美等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū),乳腺癌的發(fā)病率已占女性惡性腫瘤首位;在我國(guó),雖乳腺癌發(fā)病率較低,但近些年來有明顯上升趨勢(shì),并呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)。乳腺癌是一種激素誘發(fā)的腫瘤,根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)分泌治療已有100多年的歷史。選擇將雌激素受體(estrogen receptor,ER)作為乳腺癌病人預(yù)后評(píng)估因子以及治療靶

2、點(diǎn)有著重要的臨床意義,腫瘤活檢檢測(cè)ER已經(jīng)成為選擇治療方案的常規(guī)檢測(cè)手段。目前,對(duì)ER陽性乳腺癌的第一線療法是雌激素受體拮抗劑,如他莫昔芬等藥物。但約有30％的患者在接受他莫昔芬類藥物內(nèi)分泌治療后并沒有取得明顯的治療效果,會(huì)出現(xiàn)原發(fā)或者繼發(fā)性耐藥現(xiàn)象,其抗藥耐藥原因目前不是很明確,近年來對(duì)其耐藥機(jī)制的研究也成為此方面學(xué)者研究的熱點(diǎn)。在繼發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)雌激素受體ERα后約10年,1996年成功地克隆及鑒定了第二個(gè)雌激素受體ERβ。從而ERβ

3、的檢測(cè),在乳腺癌中的潛在應(yīng)用價(jià)值及在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后評(píng)估和內(nèi)分泌治療效果評(píng)估等方面的研究日益受到重視。但是目前,臨床實(shí)驗(yàn)室采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌的ER表達(dá)水平時(shí),使用的抗體大多只針對(duì)ERα或不能有效的區(qū)分ERα和ERβ。國(guó)內(nèi)外研究界關(guān)于ERβ在乳腺癌患者他莫昔芬耐藥中的作用研究非常少,而且各實(shí)驗(yàn)小組的研究結(jié)果差異很大,甚至結(jié)論截然相反;能否將ERβ作為評(píng)估乳腺癌內(nèi)分泌治療預(yù)后的一個(gè)指標(biāo),也尚無定論。本課題旨在通過使用更加靈

4、敏、高效的方法改變?nèi)橄侔┘?xì)胞系本身的ERβ水平,進(jìn)而在此基礎(chǔ)上通過一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的反應(yīng)性,以明確ERβ水平在他莫昔芬內(nèi)分泌治療耐藥中可能的作用,并試圖闡明其可能分子機(jī)制,進(jìn)而為臨床更合理、有效應(yīng)用雌激素受體拮抗劑等內(nèi)分泌藥物治療乳腺癌提供直接的、有價(jià)值的參考資料。實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)旨在通過使用更加靈敏、高效的方法改變?nèi)橄侔┘?xì)胞系本身的ERβ水平,進(jìn)而在此基礎(chǔ)上通過一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察這些細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的反應(yīng)性;以明確ERβ水

5、平在他莫昔芬內(nèi)分泌治療耐藥中可能的作用,并試圖闡明其可能的分子機(jī)制,進(jìn)而為臨床更合理、有效應(yīng)用雌激素受體拮抗劑等內(nèi)分泌藥物治療乳腺癌提供直接的、有價(jià)值的參考資料。
　　實(shí)驗(yàn)方法：1.構(gòu)建含人ERβ基因的重組慢病毒表達(dá)載體利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增克隆出人ERβ基因片段,然后利用一種克隆操作平臺(tái)Gateway技術(shù),將目的基因連接到入門載體pENTRTM3C,再經(jīng)LR重組反應(yīng)轉(zhuǎn)入到pLenti6.3/V5-DEST載體中,經(jīng)鑒定從而

6、成功構(gòu)建含人雌激素受體ERβ基因的重組慢病毒表達(dá)載體pLenti-ERβ;自Sigma公司直接選購(gòu)能有效沉默ERβ基因的慢病毒短發(fā)夾狀RNA(pLKO-shRNA),其沉默ERβ基因有效性均已經(jīng)得到驗(yàn)證。2.將上述構(gòu)建載體ERβ pLKO-shRNA,通過包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G和干涉質(zhì)粒三質(zhì)粒體系包裝慢病毒,所得病毒液感染乳腺癌細(xì)胞株T47D和MCF-7;瞬轉(zhuǎn)48h,常規(guī)提取對(duì)應(yīng)總RNA和蛋白經(jīng)過PCR、wester

7、n-blot鑒定,分別初篩選出對(duì)ERβ基因干涉效果明顯的靶點(diǎn)(每株細(xì)胞選出兩個(gè)靶點(diǎn))并加一定濃度嘌呤霉素(puromycin1mg/L)連續(xù)加壓篩選4W;待細(xì)胞不再死亡(此時(shí)空白對(duì)照con組細(xì)胞已完全殺死),表明陽性克隆已形成。并再次分別從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證ERβ基因表達(dá)量。建立穩(wěn)定下調(diào)ERβ基因水平乳腺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株T47D和MCF-7。3.以所構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)ERβ基因的兩乳腺癌細(xì)胞株作為研究對(duì)象,分別從細(xì)胞增殖和凋亡等方面,觀察

8、乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特征及對(duì)他莫昔芬反應(yīng)性的變化。涉及實(shí)驗(yàn)方法有:MTT法(3-(4,5dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,四甲基偶氮唑藍(lán))、EdU法(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,5-乙炔基-2,脫氧尿嘧啶核苷)、FCM(流式細(xì)胞技術(shù))以及TUNEL法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TdT介導(dǎo)的脫氧三磷

9、酸尿苷缺口末端標(biāo)記法)等,在此基礎(chǔ)上,著重利用western-blot(蛋白免疫印跡)法從細(xì)胞凋亡相關(guān)分子入手,探究下調(diào)ERβ基因水平引起乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬反應(yīng)性改變的可能分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.構(gòu)建含人ERβ基因的重組慢病毒表達(dá)載體所構(gòu)建載體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、PCR和基因測(cè)序鑒定結(jié)果顯示,已成功構(gòu)建含人ERβ基因的重組慢病毒表達(dá)載體(pLenti-ERβ);針對(duì)靶向下調(diào)ERβ基因的pLKO-shRNA慢病毒表達(dá)載體的有效

10、性已由所購(gòu)公司驗(yàn)證。2.成功建立穩(wěn)定下調(diào)ERβ基因水平乳腺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株T47D和MCF-7首先成功初篩選出干涉效果最明顯兩個(gè)靶點(diǎn),即T47D細(xì)胞(pLKO-shRNA-3326/3327)和MCF-7細(xì)胞(pLKO-shRNA-3325/3326),并以此作后續(xù)實(shí)驗(yàn):加一定濃度嘌呤霉素連續(xù)加壓篩選4W后,mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證ERβ表達(dá)量,RT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組ERβ mRNA的表達(dá)明顯降低,兩細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組ERβ

11、mRNA下調(diào)率分別達(dá)(61.12±3.66)％、(76.47±3.16)％(T47D)和(62.42±0.07)％、(42.49±1.96)％(MCF-7);western-blot法檢測(cè)兩乳腺癌細(xì)胞株ERβ蛋白表達(dá)水平:所得兩細(xì)胞株各自對(duì)照組(con、scr)、實(shí)驗(yàn)組(T47D-ERβ-s1/s2和MCF-7-ERβ-s1/s2) ERβ蛋白表達(dá),經(jīng)軟件圖像分析,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組ERβ蛋白表達(dá)量均有明顯降低:其中T47D-ERβ-

12、s1、s2兩組蛋白量分別下調(diào)率為(60.83±3.07)％和(53.31±3.00)％;MCF-7-ERβ-s1、s2兩組下調(diào)率達(dá)(83.69±5.07)％和(73.16±13.21)％。而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,ERβ蛋白表達(dá)無明顯變化。以上結(jié)果均為3次測(cè)量結(jié)果。3.穩(wěn)定下調(diào)ERβ基因水平的兩株乳腺癌細(xì)胞株為基礎(chǔ),分別從細(xì)胞增殖、凋亡等方面檢測(cè)在下調(diào)ERβ水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特征、細(xì)胞對(duì)他莫昔芬反應(yīng)性的影響:①M(fèi)TT法檢測(cè)下調(diào)E

13、Rβ水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及對(duì)TAM反應(yīng)性影響兩株細(xì)胞系scramble、s1和s2三組細(xì)胞,不同濃度TAM作用48h, T47D細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組s1、s2自TAM10μM時(shí)開始,其細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組(scramble),且在TAM為15μM時(shí)差異最為明顯(P<0.05);MCF-7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組s1、s2自TAM5μM時(shí)開始,其細(xì)胞存活率開始低于對(duì)照組(scramble),且在TAM為10~15μM時(shí)差異最為明顯(P<0.05)。而兩實(shí)驗(yàn)組

14、s1和s2之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此提示,下調(diào)ERβ水平可提高一定濃度TAM對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制性。②EdU法測(cè)定下調(diào)ERβ水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞DNA變化EdU法檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞株DNA增殖情況:在不加TAM時(shí),T47D-s1/s2兩組細(xì)胞EdU標(biāo)記陽性率高于T47D-scramble組;然而在15μM TAM作用48h后檢測(cè)結(jié)果顯示,T47D-s1/s2兩組細(xì)胞EdU標(biāo)記陽性率幾乎為零,明顯低于T47D-scrambl

15、e組(P<0.05)。MCF-7-scramble、s1和s2三組細(xì)胞比較EdU標(biāo)記陽性率,得到與T47D細(xì)胞類似的結(jié)果。由此提示,下調(diào)ERβ水平一定程度上可刺激乳腺癌細(xì)胞自身增殖,但卻可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)TAM藥物的敏感性。③流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)下調(diào)ERβ水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響FCM法檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞凋亡情況:在不加TAM時(shí),T47D-scramble/s1/s2三組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡無明顯差異(P>0.05);在15μM TAM作

16、用48h后檢測(cè)結(jié)果顯示,T47D-s1/s2兩組細(xì)胞凋亡率明顯高于T47D-scramble組(P<0.05),兩實(shí)驗(yàn)組間無明顯差異(P>0.05)。MCF-7-scramble、s1和s2三組細(xì)胞比較亦得到與T47D細(xì)胞類似的結(jié)果。上述結(jié)果提示,下調(diào)ERβ水平可以增強(qiáng)TAM藥物的誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡作用。④TUNEL法測(cè)定兩株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系各組細(xì)胞在TAM作用下細(xì)胞凋亡情況:其中T47D-s1和s2兩實(shí)驗(yàn)組中凋亡細(xì)胞明顯多于對(duì)照組,差異有顯

17、著性(P<0.05);而MCF-7-s2實(shí)驗(yàn)組中凋亡細(xì)胞數(shù)多于其他兩組,其中s2組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑤通過western blot檢測(cè)T47D-scramble/S1/S2三組細(xì)胞caspase-3及PARP的表達(dá),TAM組中T47D-S1/S2兩組活化亞基cleved-caspase-3和PARP剪切片段85KD表達(dá)明顯大于對(duì)照組;而不加TAM組,三組細(xì)胞caspase-3及其活化亞基分子和PARP表達(dá)則無明

18、顯差異。
　　結(jié)論：1.雌激素受體(ER)陽性乳腺癌細(xì)胞株T47D和MCF-7,下調(diào)其ERβ基因表達(dá)量一定程度上可能刺激乳腺癌細(xì)胞本身的增殖,但卻可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)TAM藥物的敏感性,表現(xiàn)為相同藥物濃度作用下,他莫昔芬對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng),并且可明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.下調(diào)乳腺癌細(xì)胞ERβ基因表達(dá)水平增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)TAM藥物的敏感性,其過程可能是通過增強(qiáng)如caspase-3等凋亡相關(guān)分子的剪切活化作用而引起細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。據(jù)本實(shí)驗(yàn)