色素上皮衍生因子聯(lián)合巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液或晶狀體損傷對(duì)視神經(jīng)損傷的修復(fù)作用.pdf

1、研究背景：
　　視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）將視覺信號(hào)傳入大腦，但是神經(jīng)損傷或疾?。ㄈ缜喙庋郏┛偸菚?huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡和視功能的喪失。成年哺乳動(dòng)物視神經(jīng)損傷后RGCs的軸突很難再生。要修復(fù)受損的視神經(jīng)必須保護(hù)神經(jīng)元的存活和促進(jìn)軸突的再生。色素上皮衍生因子（PEDF）是一種具有抗血管生成、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用的蛋白，能夠保護(hù)神經(jīng)元免受多種病理性的損害。另外它還具有抗炎能力。當(dāng)視神經(jīng)損傷時(shí)晶狀體同時(shí)損傷，許多RGCs可以存活，而且其軸

2、突再生進(jìn)入遠(yuǎn)端視神經(jīng)。晶狀體損傷可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，巨噬細(xì)胞能夠分泌多種刺激RGCs軸突再生的細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞在這個(gè)過程中似乎起關(guān)鍵作用，因?yàn)閱为?dú)玻璃體注射酵母多糖而沒有晶狀體損傷，也可以誘導(dǎo)RGCs軸突再生進(jìn)入遠(yuǎn)端視神經(jīng)，而酵母多糖可以刺激組織的單個(gè)核細(xì)胞。
　　目的：
　　本研究探討聯(lián)合兩種方法，即PEDF聯(lián)合巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液（MCM）或晶狀體損傷是否能協(xié)同保護(hù)RGCs的存活和促進(jìn)RGCs軸突的再生。
　　方

3、法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)出生24h的SD仔鼠的RGC細(xì)胞以及SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，觀察它們的形態(tài)、進(jìn)行免疫組化鑒定，用MTT法繪制它們的生存曲線，揭示它們的培養(yǎng)規(guī)律。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：（1）巨噬細(xì)胞與酵母多糖共培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液中血清對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬酵母多糖顆粒的影響。（2）制備細(xì)胞爬片及MCM，觀察聯(lián)合應(yīng)用PEDF和MCM對(duì)培養(yǎng)的RGC細(xì)胞的存活數(shù)和軸突再生長(zhǎng)度的影響。
　　3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：（1）將熒光金注射到SD成

4、年大鼠及出生2w的SD幼鼠腦內(nèi)，逆行性標(biāo)記RGC細(xì)胞，觀察RGCs的分布規(guī)律和細(xì)胞數(shù)目。（2）制備視神經(jīng)損傷模型和晶狀體損傷模型，觀察聯(lián)合應(yīng)用玻璃體注射PEDF和晶狀體損傷對(duì)視網(wǎng)膜RGC細(xì)胞的存活數(shù)、視神經(jīng)軸突再生以及GAP-43mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：（1）成功培養(yǎng)了SD大鼠RGC細(xì)胞，GAP-43呈陽性，培養(yǎng)第4d時(shí)，有71.4％細(xì)胞存活，而到第6d時(shí)，大量細(xì)胞開始死亡，46.3％細(xì)胞存活，第

5、8d時(shí)，只有7.1％細(xì)胞存活。（2）成功培養(yǎng)了SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，CD68呈陽性，可以存活2w左右，在培養(yǎng)第8d時(shí)，約有一半細(xì)胞死亡。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：（1）巨噬細(xì)胞同酵母多糖共培養(yǎng)2d，血清組細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組（P<0.01）。（2）觀察對(duì)RGCs存活數(shù)目的影響：MCM組在細(xì)胞培養(yǎng)第3d時(shí)細(xì)胞數(shù)目為31.4±3.7（P<0.05），PEDF聯(lián)合MCM組為34.7±4.2（P<0.01），而對(duì)照組為27.6±2.2，與對(duì)照組均有

6、顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PEDF聯(lián)合MCM組的細(xì)胞數(shù)大于MCM組，兩者有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。對(duì)RGC軸突再生的影響：細(xì)胞培養(yǎng)第3d時(shí)，MCM組細(xì)胞軸突長(zhǎng)度為57.6±3.7μm，PEDF聯(lián)合MCM組的細(xì)胞軸突長(zhǎng)度為88.6±9.5μm，與對(duì)照組（41.8±5.4μm）均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。PEDF聯(lián)合MCM組的軸突長(zhǎng)于MCM組（P<0.01）。
　　3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：（1）成功制備熒光金逆標(biāo)模型，RGCs密度為221

7、9±113RGC/mm2。（2）玻璃體注射PEDF聯(lián)合晶狀體損傷可以大幅提高視神經(jīng)損傷后RGCs存活數(shù)目。與單獨(dú)應(yīng)用玻璃體注射PEDF或晶狀體損傷相比，兩者聯(lián)合可以增加RGCs總存活數(shù)（1411±84RGC/mm2），與前兩者均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。單純的晶狀體損傷能夠刺激遠(yuǎn)端的RGCs軸突再生，PEDF聯(lián)合晶狀體損傷能夠強(qiáng)烈刺激遠(yuǎn)端視神經(jīng)軸突再生，與晶狀體損傷組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。PEDF聯(lián)合晶狀體損傷在同一

8、時(shí)間點(diǎn)可以大幅提高視神經(jīng)損傷后GAP-43mRNA的表達(dá)，與兩者單獨(dú)進(jìn)行干預(yù)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.血清能夠刺激巨噬細(xì)胞的吞噬功能。
　　2.單獨(dú)應(yīng)用PEDF不能保護(hù)培養(yǎng)的RGC細(xì)胞存活以及促進(jìn)軸突再生，MCM能保護(hù)RGC細(xì)胞存活以及促進(jìn)軸突再生，與PEDF可以協(xié)同保護(hù)RGC細(xì)胞存活以及促進(jìn)軸突再生。
　　3.玻璃體內(nèi)注射PEDF和晶狀體損傷都可以增加RGCs存活數(shù)目，兩者可以協(xié)