分子嵌合MHC-I基因小鼠骨髓pre-T細胞的構(gòu)建及體外實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建分子嵌合MHC-1基因小鼠骨髓前體T細胞，探討其預輸注受體降低受體小鼠對供體小鼠來源T細胞刺激反應能力的影響，為研究分子嵌合誘導移植免疫耐受打下基礎(chǔ)。
　　方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術(shù)獲取C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb，分別將其連入質(zhì)粒pIRES，構(gòu)建pIRES-H-2Db、pIRES-H-2Kb質(zhì)粒，雙酶切電泳檢測和測序鑒定插入序列。培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓造血干細胞

2、，細胞因子IL-3和SCF誘導分化，流式細胞術(shù)檢測前體T細胞(pre-T細胞)表面標志Thv-1.2+、CD3-。脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染(C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb入BALB/c小鼠pre-T細胞。流式細胞術(shù)檢測BALB/c小鼠pre-T細胞H-2Db和H-2Kb蛋白的表達。將轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因的BALB/c小鼠pre-T細胞經(jīng)尾靜脈注射回BALB/c小鼠，飼養(yǎng)7天后取其脾細胞作為反應細胞，

3、用C57BL/6小鼠的脾細胞做刺激細胞，單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，改良MTT法檢測其增殖效果。
　　結(jié)果：①成功獲取C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb，構(gòu)建質(zhì)粒pIRES-H-2Db和pIRES-H-2Kb，雙酶切鑒定插入序列大小正確，并經(jīng)測序與Genbank上H-2Db和H-2Kb序列完全一致。②成功體外培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓pre-T細胞，流式細胞術(shù)檢測Thy-1.2+、CD3-細胞的比例可達64.8％。

4、③脂質(zhì)體成功轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db，流式細胞術(shù)檢測H-2Db蛋白表達為14.6％，與未轉(zhuǎn)染組(0.1％)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(0.3％)相比有明顯升高(p<0.05)；轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Kb，流式細胞術(shù)檢測H-2Kb蛋白表達為14.8％，與未轉(zhuǎn)染組(0.1％)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(0.3％)相比亦有明顯升高(p<0.05)。④單向混合淋巴細胞培養(yǎng)顯示，共注射組的刺激指數(shù)(SI)(0.764±0

5、.074)比空質(zhì)粒組SI(0.983±0.081)和未轉(zhuǎn)染組SI(0.994±0.142)明顯下降(P<0.01)；共注射組與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-H-2Db組(0.859±0.085)、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-H-2Kb(0.860±0.097)相比，SI值差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-H-2Db組、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-H-2Kb組與未注射組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組分別比較，差異亦有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染

6、空質(zhì)粒組的SI值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：①成功構(gòu)建C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb真核表達質(zhì)粒。②細胞因子誘導可體外收獲BALB/c小鼠骨髓pre-T細胞。⑧C57BL/6小鼠MHC-I等位基因H-2Db和H-2Kb成功體外轉(zhuǎn)染至BALB/c小鼠pre-T細胞，且轉(zhuǎn)染后可穩(wěn)定表達。④體外成功獲得分子嵌合MHC-I等位基因受體小鼠pre-T細胞，其能降低受體對異基因供體來源T細胞刺激的