WRAP53在食管鱗狀細胞癌中的表達及其作用機制的初步研究.pdf

1、目的:
　　食管鱗狀細胞癌惡性度高、預(yù)后差，食管癌發(fā)生、發(fā)展根本的分子生物學(xué)機制尚不清楚。近年來WRAP53(也被稱為TCAB1或WDR79)作為腫瘤抑制基因p53的反義基因引起人們的廣泛注意。最初對于 WRAP53的研究集中于其轉(zhuǎn)錄本對于正義基因 p53轉(zhuǎn)錄本的正向調(diào)控機制，同時證明了WRAP53敲除抑制DNA損害時P53的誘導(dǎo)。最近的研究則集中于其所編碼的蛋白質(zhì)的功能。WRAP53蛋白質(zhì)是活性端粒酶蛋白的新成員，對端粒酶全酶的

2、組裝、在Cajal小體的累積以及行使功能以確保端粒的延長都是必須的。WRAP53蛋白能通過增加染色體末端端粒的長度促進祖細胞和腫瘤細胞的增殖，促進多種癌細胞的生存。但WRAP53 mRNA和蛋白在食管癌腫瘤組織中的表達及功能狀態(tài)尚未見報道，本研究的目的致力于闡明食管鱗狀細胞癌腫瘤組織中WRAP53mRNA和蛋白的表達差異及其與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并對WRAP53表達下調(diào)對食管鱗狀細胞癌細胞株的增殖和凋亡的影響做一初

3、步研究。
　　方法:
　　1.運用免疫印跡法和實時定量 PCR技術(shù)分別檢測食管鱗狀細胞癌細胞系(EC109， EC9706，KYSE150和KYSE180)、45對食管鱗狀細胞癌組織和癌周正常食管粘膜上皮組織中WRAP53蛋白及WRAP53 mRNA的表達。
　　2.用免疫組織化學(xué)染色法對115例食管癌患者的食管鱗狀細胞癌組織和85例癌周正常食管粘膜上皮組織（前面45對組織包括在內(nèi)）中的WRAP53蛋白的表達進行半定量

4、測定，全面描述WRAP53在食管鱗狀細胞癌組織和癌周正常食管粘膜上皮組織的表達特點，結(jié)合臨床資料進行綜合分析和統(tǒng)計學(xué)處理。
　　3.應(yīng)用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將特異性siWRAP53作用于食管鱗狀細胞癌細胞株EC109細胞使其WRAP53表達下調(diào)，MTT法用于檢測 WRAP53表達下調(diào)對食管鱗狀細胞癌細胞株 EC109增殖的影響，免疫印跡法檢測 WRAP53表達下調(diào)對凋亡蛋白BAX的影響，流式細胞術(shù)檢測食管鱗狀細胞癌細胞株 EC109凋亡率

5、的變化，證實 WRAP53表達下調(diào)對食管鱗狀細胞癌細胞株EC109細胞生長及凋亡的作用，應(yīng)用細胞周期非特異性抗癌藥物順鉑處理EC109，檢測WRAP53在RNA及蛋白水平的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、食管鱗狀細胞癌細胞系(EC109，EC9706，KYSE150和KYSE180)均能檢測到WRAP53蛋白和mRNA的表達，但WRAP53蛋白和mRNA的相對表達量有明顯的不同，原始腫瘤外侵較深的KYSE150和KYSE18

6、0（T4）WRAP53的表達明顯高于原始腫瘤外侵較淺的EC109和EC9706（T3）；WRAP53蛋白和mRNA在食管鱗狀細胞癌腫瘤組織中的表達較癌周正常粘膜上皮組織中的表達明顯升高(P＜0.001)。
　　2、免疫組織化學(xué)檢測顯示食管鱗狀細胞癌組織WRAP53蛋白的陽性表達率明顯高于癌周正常粘膜上皮組織(P<0.001)；食管鱗狀細胞癌組織及癌周正常粘膜上皮組織中WRAP53主要定位于細胞核上,顯示黃色或者棕黃色染色，食管鱗狀

7、細胞癌組織陽性表達明顯高于癌周正常組織（包括癌周粘膜上皮組織、間質(zhì)組織、神經(jīng)組織、平滑肌組織等）；低分化的食管鱗狀細胞癌組織表現(xiàn)為強陽性表達，可見核分裂象上染色；高分化的食管鱗狀細胞癌組織中，癌巢中間的角化珠特別是充分角化的腫瘤細胞呈陰性表達；癌巢周邊幼稚的腫瘤細胞呈陽性表達，癌巢中央成熟的腫瘤細胞則表達逐漸降低。癌周食管正常粘膜上皮組織陰性或弱陽性表達，突出顯示為基底細胞和基底細胞層上方細胞核染色,上皮內(nèi)乳頭狀增生組織細胞陽性表達，鱗

8、狀上皮中層和表層呈陰性表達；WRAP53蛋白表達與食管鱗狀細胞癌原發(fā)腫瘤浸潤程度,TNM臨床分期顯著正相關(guān)(P=0.001、P=0.007)，與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(P=0.026)，與年齡、性別、病理分化程度無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。
　　3、WRAP53表達下調(diào)能抑制食管鱗狀細胞癌細胞株EC109細胞的增殖，同時WRAP53表達下調(diào)能增加EC109細胞BAX蛋白的表達和EC109細胞的凋亡率，細胞周期非特異性抗癌藥物順鉑能

9、在RNA和蛋白水平降低WRAP53的表達。
　　結(jié)論:
　　1.系統(tǒng)地證明了食管腫瘤組織及相應(yīng)正常組織中WRAP53蛋白和WRAP53mRNA的表達差異，WRAP53蛋白和WRAP53mRNA在食管鱗狀細胞癌組織中的表達較癌周正常粘膜上皮組織中的表達上調(diào)。
　　2.免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果揭示了食管鱗狀細胞癌組織 WRAP53蛋白分布的特點：集中于細胞核，可能在基因水平上發(fā)揮生物學(xué)作用；與腫瘤細胞的分化程度有關(guān)，低分化高表

10、達的特征明顯，癌周食管正常粘膜上皮組織突出顯示為基底細胞和基底細胞層上方細胞核染色，在分化成熟癌巢中央和角化珠中的鱗癌細胞以及鱗狀上皮中層及表層細胞很低甚至呈陰性表達，提示了WRAP53與細胞增殖的相關(guān)性；WRAP53蛋白表達與食管癌原發(fā)腫瘤浸潤程度、臨床分期顯著正相關(guān)(P=0.001、P=0.007)，與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(P=0.026)，與年齡、性別、病理分化程度無明顯相關(guān)（P>0.05）。KYSE150和KYSE180的WRA

11、P53的表達明顯高于EC109和EC9706，進一步確定WRAP53表達與食管癌原始腫瘤浸潤程度的相關(guān)性，WRAP53的表達升高可以作為判斷食管鱗狀細胞癌侵蝕、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。
　　3. WRAP53表達下調(diào)促進食管鱗狀細胞癌細胞株EC109細胞的凋亡，促使凋亡蛋白BAX的表達升高，進一步提示W(wǎng)RAP53表達的在食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮的作用?？拱┧幬镯樸K能使WRAP53 mRNA和蛋白得表達下調(diào)，WRAP53有望成為一