特異、敏感的肝細胞HBVcccDNA熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、目的：探索和建立特異、敏感、可靠的熒光定量PCR方法檢測肝細胞內(nèi)HBVcccDNA。 方法：取HBsAg陽性37例的慢乙肝、30例慢乙肝合并肝癌患者的肝組織和7例血清標記物及HBVDNA均陰性的非慢乙肝患者肝組織，用蛋白酶K裂解法釋放肝細胞核內(nèi)HBV DNA及基因組DNA后，采用濾柱法抽提DNA。用ATP依賴的DNA酶消化單鏈的DNA，設計檢測cccDNA和tDNA的特異性引物和探針進行熒光定量PCR擴增。同時以HBV全基因重組

2、質(zhì)粒pAM6做HBVcccDNA及tDNA檢測的標準陽性對照，并制作標準曲線。擴增樣本看家基因β-2M計算每次反應的細胞數(shù)進行絕對HBVcccDNA和tDNA的細胞定量(計算每個細胞含有的病毒拷貝數(shù))。將己知拷貝數(shù)的此重組質(zhì)粒pAM6參入HBV陰性的正常肝組織中，同時提取并檢測HBVcccDNA和tDNA的拷貝數(shù)以評價操作過程中可能的損失率，加以矯正，使得定量結果精確、可靠。 結果：本方法可以檢測標準質(zhì)粒、肝癌和慢乙肝肝組織標本

3、的cccDNA、tDNA、β-2M范圍均為103-109拷貝/PCR。其中肝癌組cccDNA檢出率為73％，tDNA檢出率為100％；慢乙肝組cccDNA檢出率為75％，tDNA檢出率為89％。陰性對照組檢測cccDNA和tDNA均為陰性。所有肝組織標本的β-2M檢出率為100％。 結論：本實驗室研究建立的肝組織HBVcccDNA熒光定量檢測方法是特異性高、敏感性好、準確的、可靠且實用性強?？捎糜诙繖z測肝細胞內(nèi)的cccDNA的