應用OWLS研究靶序列二級結(jié)構(gòu)對固-液界面NDA雜交動力學的影響.pdf

1、目的:
　　 基因芯片技術自上世紀80年代初誕生以來,以其高通量、速度快、成本低等優(yōu)點,取得了長足的發(fā)展。特別是在基因表達譜分析、測序、基因突變檢測、SNP檢測、臨床疾病診斷等領域已得到了廣泛的應用。然而現(xiàn)階段基因芯片技術存在的瓶頸問題是基因芯片雜交結(jié)果重復性較差,限制了其發(fā)展和臨床應用。我們利用OWLS非標記檢測技術觀測到當靶序列長于探針序列時,由于靶序列及其與探針雜交后的游離端在溶液中會形成立體結(jié)構(gòu),而具有立體結(jié)構(gòu)的靶序列分

2、子的熱力學擴散運動,不僅影響雜交體的形成,還會使雜交體的解離常數(shù)增加,甚至使雜交體不能穩(wěn)定存在。靶序列分子結(jié)構(gòu)是影響雜交動力學的重要因素。
　　 OWLS能夠提供一個溫度可調(diào)(T變化小于0.1℃)的恒溫外循環(huán)雜交體系平臺,其外接的微流體控制系統(tǒng)能夠不斷地將預先注入樣品池的樣品補充到雜交反應池內(nèi),維持雜交反應池內(nèi)在雜交過程中靶序列濃度相對恒定。且OWLS是非標記的檢測方法,通過實時檢測雜交信號NTE和NTM的變化,應用OWLS自身

3、轉(zhuǎn)換軟件將NTE或NTM換算成Mass、dM/dT(M)等與動力學相關的數(shù)據(jù)結(jié)果并通過屏幕多個窗口一同顯示,從而研究人員可以實時監(jiān)測雜交動力學的動態(tài)過程。
　　 本課題的目的是研究不同類型靶核酸二級結(jié)構(gòu)和靶核酸熱力學擴散對固/液界面核酸雜交動力學過程的影響。研究的意義在于探明不同靶序列的二級結(jié)構(gòu)在一定條件下與已知序列探針的雜交動力學影響的規(guī)律,從而為基因芯片探針設計提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　 材料和方法:
　　

4、 一、實驗材料
　　 HBV特異基因片段(C亞型)(由本實驗室篩選合成)
　　 OWLSTM120(MicroVacuumLtd,Hungary)
　　 熒光圖像掃描儀(GeneTACTMLSIV,GenomicSolutionsInc.USA)
　　 202-0數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(上海陽光試驗儀器公司)
　　 二、實驗方法
　　 1、用PrimerPremier5.0軟件設計探針和靶序

5、列
　　 2、熒光標記法確定探針及靶序列最佳雜交濃度
　　 3、用接觸式點樣方法在芯片上固定探針
　　 4、化學法再生傳感器芯片
　　 5、光波導模式譜法(OWLS)檢測傳感器芯片表面探針結(jié)合靶序列的質(zhì)量變化
　　 結(jié)果:
　　 1、探針及靶序列的設計:以HBV的C亞型基因為模板,應用PrimerPremier5.0軟件,設計三組探針和不同長度的靶序列,并應用Mfold軟件預測3組探針和靶

6、序列的二級結(jié)構(gòu)。
　　 2、探針及靶序列最佳雜交濃度的確定:探針的濃度確定為25μM:靶序列的濃度確定為2μM。
　　 3、SchiffBase鍵的穩(wěn)定性:未經(jīng)硼氫化鈉處理的探針與靶序列T75雜交形成的雜交體,能夠使探針從芯片上脫落,導致OWLS基線下移,表明SchiffBase鍵不穩(wěn)定,在一定條件下,會斷裂。
　　 4、利用OWLS獲得相同面密度探針與長度不同靶序列雜交動力學數(shù)據(jù):相同面密度的探針與不同二級結(jié)構(gòu)

7、的靶序列雜交結(jié)合速率常數(shù)和靶序列洗脫率差異顯著,主要是由于靶序列二級結(jié)構(gòu)不同導致的。靶序列二級結(jié)構(gòu)越復雜,表觀速率常數(shù)越小,靶序列洗脫率越大。
　　 結(jié)論:
　　 1、SchiffBase鍵不穩(wěn)定。
　　 2、應用OWLS研究相同面密度的探針與不同長度的靶序列雜交動力學過程,探針與靶序列雜交反應的表觀速率常數(shù)、結(jié)合靶序列摩爾數(shù)之間存在很大差異,靶序列的二級結(jié)構(gòu)是影響以上動力學參數(shù)的關鍵因素。
　　 3、影