囊尾蚴病多期復合基因疫苗的構建及免疫效應評價.pdf

1、目的：(1)構建包含豬帶絳蟲六鉤蚴期和囊尾蚴期特異性疫苗候選分子的囊尾蚴病多期復合基因疫苗。(2)評價該復合基因疫苗的免疫效應。
　　方法：(1)分別提取豬帶絳蟲六鉤蚴和囊尾蚴總RNA，應用RT-PCR方法分別擴增六鉤蚴期特異性抗原 TSOL18和囊尾蚴期特異性抗原 cC1編碼基因，另外設計引物應用重疊延伸PCR技術通過一柔性接頭（linker）(Gly4Ser)3串聯(lián)這兩個基因，使TSOL18基因在前，cC1基因在后，即融合基因

2、TSOL18+linker+cC1（簡寫為TSOL18/L/cC1）。將TSOL18/L/cC1融合基因裝載至pMD18-T載體中，并測序驗證。提取pMD18-TSOL18/L/cC1質粒DNA，經(jīng)Xho I和Nhe I雙酶切，純化后的酶切產(chǎn)物TSOL18/L/cC1基因通過T4連接酶與經(jīng)Xho I和Nhe I雙酶切并純化的pVAX1真核表達質粒連接，構建pVAX1-TSOL18/L/cC1重組質粒，同時構建 pVAX1-TSOL18,

3、 pVAX1-cC1。將所構建的重組質粒通過陽離子聚合物介導轉染293T細胞，設轉染pVAX1空載體組和未轉染組轉染；轉染72 h后分別收集細胞，提取轉染后的細胞總RNA，通過RT-PCR、間接免疫熒光、Western-blot鑒定融合基因在真核細胞中的表達狀態(tài)；以構建的重組質粒肌肉注射小鼠，以免疫組化檢測融合基因在小鼠骨骼肌的真核表達效果。（2）以 pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1、pVAX1-TSOL18/L/cC1經(jīng)肌

4、肉注射途徑免疫BALB/c小鼠，以流式細胞術檢測免疫后小鼠脾淋巴細胞胞內細胞因子等細胞免疫指標，并以間接ELISA法檢測相應的特異性抗體及特異性抗體動態(tài)變化等體液免疫指標。
　　結果：(1)構建的pVAX1-TSOL18/L/cC1重組質粒經(jīng)酶切電泳和測序結果與預期設計的基因序列一致。真核細胞轉染后通過RT-PCR檢測顯示除轉染pVAX1空載體組和未轉染組外，其余各組均有相應 mRNA的表達。真核細胞轉染后通過間接免疫熒光、Wes

5、tern-blot檢測表明能夠在293T細胞中表達出目的蛋白。免疫組化染色后在重組質粒注射部位肌肉組織的肌纖維內顯示棕黃色陽性分泌顆粒，并且pVAX1-TSOL18/L/cC1組比pVAX1-TSOL18組棕黃色陽性分泌顆粒多，空載體組與空白對照組骨骼肌組織未見明顯的棕黃色顆粒。（2） pVAX1-TSOL18/L/cC1組小鼠血清 IgG抗體均顯著高于 pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組及 PBS組和 pVAX1組（P<0

6、.05)。 pVAX1-TSOL18/L/cC1組、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組分泌IFN-γ的CD4+T及CD8+T細胞各亞群比例均顯著高于PBS組和pVAX1組（P<0.05)， pVAX1-TSOL18/L/cC1組又顯著高于 pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組（P<0.05)；pVAX1-TSOL18/L/cC1組、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組分泌IL-4的CD4+T細胞亞群比例顯

7、著高于PBS組和 pVAX1組（P<0.05)，而 pVAX1-TSOL18/L/cC1組、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組與PBS組和pVAX1組組間無顯著差異（P＞0.05）；pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組分泌IL-4的CD8+T細胞亞群比例顯著高于PBS組和pVAX1組（P<0.05)，而pVAX1-TSOL18/L/cC1組與與PBS組和pVAX1組組間無顯著差異（P＞0.05）。
　　結論：