KDEL受體蛋白通過自噬作用參與神經退行性疾病的潛在功能研究.pdf

1、中國科學技術大學博士學位論文KDEL受體蛋白通過自噬作用參與神經退行性疾病的潛在功能研究姓名：汪平平申請學位級別：博士專業(yè)：神經生物學指導教師：王光輝2011-05摘 要 II 體的表達量的增加而更顯著。GFP-LC3 的熒光定位也由均勻的胞漿分布轉變成明亮的點狀分布。 使用透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構， 能夠發(fā)現(xiàn)其中大量雙層膜的自噬體結構。這些結果說明細胞內自噬體數量的增多。 在穩(wěn)定表達自噬經典底物 GFP-p62 的細胞系中過表達

2、 KDEL 受體能下調GFP-p62 的蛋白水平，而在 GFP-LC3 的細胞系中過表達 KDEL 受體則會增加因降解切割而被釋放的游離 GFP 蛋白量。使用自噬溶酶體融合的抑制劑BafilomycinA1 或氯化奎寧(CQ)處理細胞檢測 LC3 蛋白的 turnover，發(fā)現(xiàn) KDEL受體誘導的 LC3II 增加效應依然存在。 這些結果表明 KDEL 受體蛋白能夠提高自噬的降解能力。因此，通過自噬體數量的增加和底物降解水平的提高可以確

3、定KDEL 受體能夠誘導細胞自噬水平的提高。 4. KDEL 受體過表達可以誘導 MAPKs 家族成員 JNKs、 p38 以及 ERKs 的激活， 而 KDEL 受體誘導的 LC3II 增加效應能夠被 MEK1/ERKs 的抑制劑 PD98059所抑制，但不受 JNKs、p38 抑制劑的影響，而在 EGFP-p62 細胞系中檢測也發(fā)現(xiàn)PD98059 能夠抑制 KDEL 受體誘導的 p62 蛋白降解。這說明 KDEL 受體誘導的自噬增強

4、是通過 MEK1-ERKs 信號通路的激活介導。 5. 相對于正常的野生型， KDEL 受體蛋白功能缺陷的突變體 D193N、 R169N喪失了誘導活化 MEK1-ERKs 信號通路的能力， 同時也不能夠誘導 LC3II 的上調以及對 GFP-p62 的降解能力，因此 KDEL 受體的突變體不能夠通過激活MEK1-ERKs 信號通路來誘導自噬增強。 6. 同樣使用 RT-PCR 的方法檢測發(fā)現(xiàn)， 神經退行性疾病相關突變蛋白的過表達，如

5、tHttQ150、α-synuclein A53T 以及 SOD1 G93A，都會誘導 KDEL 受體的mRNA 含量的增加。我們在這些突變蛋白的穩(wěn)定表達細胞系中過表達 KDEL 受體可以促進突變蛋白的降解，反之將內源性 KDEL 受體 knockdown 后則造成這些突變蛋白量的累積。在自噬缺陷的 ATG5 KO 細胞中，過表達 KDEL 受體則不能夠促進 SOD1 G93A 的降解。 因此，我們的研究結果表明，KDEL 受體蛋白通過