磷酸二酯酶抑制劑對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：以大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷為動物模型，觀察咯利普蘭(Rolipram)對學習記憶障礙的保護作用及己酮可可堿(Pentoxifylline，PTX)對腦缺血后海馬區(qū)新生細胞存活的影響，并在此基礎上探討磷酸二酯酶抑制劑的作用機制。體外培養(yǎng)海馬神經元和PC12細胞，建立缺氧/再給氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)損傷模型，觀察咯利普蘭對細胞形態(tài)及細胞活力的影響。 方法：(1)咯利普蘭(1mg/kg)連續(xù)腹

2、腔給藥15d，參照LongaEZ線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。造模后d8、d13分別對大鼠進行Morris水迷宮測試訓練和避暗測試。造模后d15，斷頭取腦并迅速取出海馬組織，制備成組織勻漿，應用高效液相色譜分析(HPLC)法測定海馬組織磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)活性。(2)體外培養(yǎng)海馬神經元和PC12細胞，分別應用物理、化學兩種方法建立細胞H/R損傷模型，觀察細胞形態(tài)學改變，并且應用四甲基偶氮唑

3、藍法(methylthiazolyltetrazolium，MTT)觀察不同濃度咯利普蘭對細胞活力的影響，測定細胞外液乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)濃度。(3)建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，造模9d后給予BrdU(50mg/kg)進行標記，4次/d，間隔2h給藥1次。標記后d7腹腔注射不同劑量的PTX(20mg/kg或40mg/kg)，連續(xù)22d。在BrdU標記后d30處死大鼠。取腦組織做冷凍切片，

4、行免疫組化法觀察PTX對大鼠缺血再灌注后腦組織海馬齒狀回BrdU陽性細胞數的影響。 結果：(1)在Morris水迷宮測試中，各組大鼠在d1的潛伏期沒有顯著差異；d4與d7模型組大鼠的潛伏期明顯延長，分別為27.700±13.407s、14.540±4.408s；咯利普蘭顯著縮短了模型大鼠的尋臺時間，潛伏期分別為15.945±8.791s、10.347±3.940s。大鼠在Morris水迷宮中到達平臺的平均路程在d4與d7均有顯著

5、差異：模型組大鼠的泳程分別為262.078±181.067cm、139.873±31.063cm；咯利普蘭組的泳程為125.292±45.707cm、110.545±14.567cm較模型組顯著縮短。在避暗實驗中，模型組大鼠的潛伏期顯著降低(110.563±61.817s)，錯誤次數顯著增加(1.125±0.991次)；咯利普蘭顯著增加了模型大鼠的潛伏期(168.500±60.564S)，錯誤次數顯著減少(0.750±0.707次)。通

6、過HPLC檢測分析得知：與正常對照組相比，模型組大鼠海馬組織PDE4活性顯著升高(34.338±7.974μmol/g/min)；與模型組相比，咯利普蘭組PDE4活性顯著降低(26.913±7.105μmol/g/min)。(2)結合海馬神經元在倒置顯微鏡下的形態(tài)學特征及神經微絲(NF200)抗原的鑒定結果，確認分離培養(yǎng)的為神經元。缺氧/再給氧損傷后，細胞形態(tài)發(fā)生了一定的改變，咯利普蘭10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L

7、三個劑量均顯著降低了缺氧/再給氧損傷對PC12細胞及海馬神經元造成的損傷：PC12細胞的A值由模型組的0.287±0.080增加到0.391±0.096、0.396±0.104、0.425±0.080；神經元的A值由0.155±0.043增加到0.236±0.041、0.244±0.089、0.253±0.054。與模型組506.658±28.412相比，應用咯利普蘭后PC12細胞各組細胞外液LDH也逐漸降低呈濃度依賴趨勢LDH分別為4

8、72.284±27.442、448.551±24.684、437.320±41.231；咯利普蘭顯著減少了海馬神經元細胞外液LDH值，從模型組的531.790±70.054U/L分別減少為404.460±89.568U/L、399.372±88.476U/L、388.428±127.281U/L。(3)在倒置顯微鏡下觀察成年大鼠腦缺血損傷后海馬齒狀回BrdU免疫陽性細胞的分布。BrdU免疫陽性細胞表現為橢圓形或不規(guī)則形狀的細胞核，并呈現

9、明顯的“叢集”現象。本實驗中陰性對照海馬齒狀回(Dentategyrus，DG)區(qū)未見BrdU免疫陽性細胞。BrdU給藥30d后，空白對照組大鼠DG區(qū)僅見少量散在的BrdU免疫陽性細胞，細胞百分比率為(100.000±18.365)，方差分析結果顯示：與空白對照組相比，模型組DG區(qū)BrdU免疫陽性細胞比率顯著增加為(129.358±18.378)，可可堿對照組免疫陽性細胞比率也有少量增加(108.217±15.743)；與模型組相比，P

10、TX20mg/kg、40mg/kg治療組BrdU免疫陽性細胞比率顯著增加，分別為(148.017±24.201、152.992±22.160)。 結論：磷酸二酯酶4抑制劑—咯利普蘭可顯著改善局灶性腦缺血再灌注損傷造成的學習記憶障礙，推測其作用機制與抑制損傷大鼠海馬區(qū)PDE4活性有關：PDE4活性降低使環(huán)磷腺苷(cyclicAdenosinemonophosphate，cAMP)水解減少，結果導致細胞內cAMP水平升高，進而活化蛋