Mfn2通過調(diào)控TGF-β抑制大鼠腹主動脈慢性排斥反應及肝纖維化.pdf

1、背景:
　　慢性排斥反應屬于遲發(fā)型變態(tài)反應，一般發(fā)生在移植后半年或數(shù)年后，呈進行性發(fā)展，其病因及機制錯綜復雜，不十分清楚，多由反復發(fā)作的急性排斥反應所造成。慢性排斥反應的病理特點為退行性及破壞性改變，表現(xiàn)為血管內(nèi)膜平滑肌細胞、間質纖維組織增生及單核巨噬細胞浸潤。慢性排斥反應有一個共同組織學表現(xiàn)即移植物動脈硬化，移植物動脈硬化早期即有明顯的VSMC凋亡，并且VSMC凋亡與血管內(nèi)膜增厚、移植物動脈硬化相關，其特征是泡沫細胞性閉塞性動脈

2、病變，如動脈內(nèi)膜增厚、內(nèi)膜的單核細胞和巨噬細胞浸潤及間質纖維化。Mfn2基因，又稱為增殖抑制基因(HSG)，它的表達產(chǎn)物抑制VSMC增殖的同時能誘導VSMC從處于增殖狀態(tài)的去分化型向分化型轉化，即HSG/Mfn2參與VSMC再分化過程。并且高表達的HSG/Mfn2基因能促進大鼠的血管平滑肌細胞(VSMC)的凋亡。但Mfn2在移植慢性排斥反應中的功能及變化尚未有相關報道。
　　肝纖維化是指由于細胞外基質的形成和降解的平衡失調(diào)導致肝內(nèi)

3、纖維組織的積累，是許多纖維組織包圍的再生結節(jié)引起的肝臟結構的廣泛破壞。肝纖維化是肝臟纖維結締組織的過度沉積，是纖維增生和纖維分解不平衡的結果。Mfn2作為一種新型的增殖抑制因子，已有研究表明其能抑制血管平滑肌細胞增殖，減少血管內(nèi)膜彈性纖維組織的增多。同時，也已有相關文獻報道在糖尿病腎病模型中，Mfn2高表達可以抑制腎間質纖維化，降低膠原4的表達。但是Mfn2對肝臟纖維化的影響尚未有相關報道。
　　目的:
　　本實驗擬通過研究

4、Mfn2對大鼠腹主動脈移植慢性排斥反應的影響以及在肝纖維化過程中的變化，探索Mfn2在纖維化過程中所起的作用以及可能的作用機制，為肝硬化的治療和移植術后降低慢性排斥反應提供一定幫助。
　　方法:
　　1.構建Mfn2-GFP慢病毒，并轉染供體Lewis大鼠移植段腹主動脈。
　　2.將轉染Mfn2-GFP的供體Lewis大鼠移植段腹主動脈移植到受體Bn大鼠的相應位置腹主動脈段，并設立轉染GFP慢病毒的陰性對照組。

5、　　3.分別于30天、60天、90天取下移植段血管，用HE染色法和masson染色法觀察血管內(nèi)膜增厚程度。并采用免疫組化測定Mfn2和慢性排斥反應相關因子TGF-β1、TGF-βR2的關系。
　　4.門靜脈注射Mfn2-GFP慢病毒轉染大鼠肝臟，并通過CC14構建大鼠肝硬化模型。
　　5.8周后取肝臟行HE和masson染色觀察肝臟形態(tài)，并利用western、免疫組化等技術檢測其中Mfn2與纖維化相關因子TGF-β1、TGF

6、-βR2、Smad3、Smad4、Smad7、膠原Ⅳ、α-SMA的表達量關系。
　　6.用Mfn2慢病毒轉染大鼠肝星狀細胞，利用western檢測其中Mfn2與纖維化相關因子TGFβ1、TGFβR2、Smad3、Smad4、Smad7、膠原Ⅳ的相互關系。
　　7.CCK8、細胞凋亡、遷移實驗檢測穩(wěn)轉Mfn2的肝星狀細胞的增殖情況。
　　結果:
　　1.通過masson染色和imagepro-plus6.0軟件測量

7、移植段大鼠腹主動脈內(nèi)膜厚度，結果提示，移植后60天和90天，轉染Mfn2-GFP的腹主動脈內(nèi)膜厚度明顯小于轉染GFP的腹主動脈內(nèi)膜厚度(p＜0.001)。
　　2.免疫組化結果證實移植后60天和90天，轉染Mfn2-GFP的腹主動脈內(nèi)膜的TGF-β1、TGF-β R2的表達量要低于轉染GFP的腹主動脈內(nèi)膜(p＜0.01)。
　　3.Masson染色結果提示:行cc14造肝硬化模型時，2周即可出現(xiàn)明顯脂肪空泡，但肝臟結構尚正常

8、;4周時開始出現(xiàn)小葉內(nèi)變性、融合壞死，纖維間隔伴小葉結構紊亂;6周出現(xiàn)較大范圍的橋接壞死，累及多個小葉，小葉結構失常，纖維間隔小于0.1mm，但纖維結節(jié)直徑大于2mm;8周出現(xiàn)較大范圍的橋接壞死，累及多個小葉，小葉結構失常，纖維間隔小于0.1mm，但纖維結節(jié)直徑小于1mm。同時masson染色提示，門靜脈注射Mfn2-GFP慢病毒的大鼠肝臟行cc14造模8周后，纖維化程度與6周肝硬化模型無明顯差別(P＞0.05)，低于8周肝硬化模型(P

9、＜0.05)。
　　4.WB和免疫組化結果提示，肝硬化組Mfn2表達量小于對照陰性組和轉染Mfn2病毒組(p＜0.05)，同時TGF-β1、TGF-βR2、Smad3、Smad4和膠原4表達量大于后兩者(p＜0.05)，提示Mfn2有抑制肝纖維化作用，且有可能是通過參與TGFβ-Smad通路降低肝纖維化。
　　結論:
　　1.轉染Mfn2的移植段腹主動脈內(nèi)膜厚度明顯小于轉染GFP組，同時免疫組化提示前者TGFβ1和TG