天然腦活素的分子基因藥效學系列研究.pdf

1、為了闡明老年癡呆中藥科研制劑天然腦活素的分子基因藥效學機理,設計并實施了以下系列實驗。 1.探討天然腦活素對Aβ1-40致阿爾茨海默氏病(AD)細胞模型的神經(jīng)毒性的保護作用及其可能的分子機制。研究采用Aβ1-40處理PC12細胞復制AD細胞模型,不同劑量的天然腦活素孵育AD模型細胞,鏡下觀察細胞形態(tài)學變化及細胞突起生長情況,計數(shù)陽性細胞率；MTT法檢測細胞增殖活度(AMTT值),免疫熒光染色觀察細胞內微管相關蛋白MAP-2的表達

2、,免疫細胞化學染色法觀察細胞凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax,Caspase-3)的表達水平。實驗發(fā)現(xiàn)：天然腦活素處理組細胞突起生長明顯,細胞增殖活度,胞內微管相關蛋白MAP-2的表達顯著高于AD模型組細胞(P<0.05 or P<0.01),細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達較模型組顯著上調,同時細胞凋亡促進蛋白Bax及介導細胞凋亡的蛋白Caspase-3的表達明顯下調(P<0.05 or P<0.01)。結果提示：天然腦活素對Aβ1-

3、40致AD細胞模型的神經(jīng)毒性具有明顯的拮抗和改善作用,其機制可能與其在一定程度上促進細胞增殖、上調胞內微管相關蛋白的表達、調節(jié)細胞凋亡相關蛋白的水平,抑制細胞凋亡等有關。 2.探討天然腦活素延緩人胚肺二倍體成纖維細胞(MRC-5)復制性衰老的作用及其分子機制。本實驗在鏡下觀察細胞形態(tài)變化,繪制細胞生長曲線,MTT法檢測細胞增殖活度,SA-β-gal染色法觀察細胞衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性的改變,計數(shù)陽性細胞率

4、；TRAP-ELISA法檢測細胞端粒酶活性的變化。我們發(fā)現(xiàn)：天然腦活素孵育的MRC-5細胞老齡化不明顯,細胞增殖能力較空白老齡對照組明顯增加(P<0.05);天然腦活素連續(xù)培養(yǎng)的細胞在老齡階段SA-β-gal陽性率均顯著低于老齡對照細胞(P<0.01);天然腦活素處理的細胞端粒酶活性較空白老齡對照組明顯上調(P<0.05)。表明：天然腦活素可能通過促進細胞增殖,激活細胞端粒酶的表達,降低SA-β-Gal酶活性,進而有效延緩細胞的復制性衰

5、老。 3.從分子基因水平，探討天然腦活素誘導骨髓間充質干細胞(MSC)向神經(jīng)元樣細胞分化的作用。選取6-8周齡SD大鼠,無菌獲取脛骨和股骨骨髓,全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)并純化大鼠MSC,應用天然腦活素誘導MSC向神經(jīng)元分化。倒置相差顯微鏡追蹤比較觀察分化過程中細胞形態(tài)的變化,免疫細胞化學和RT-PCR方法檢測神經(jīng)元特異性標志物：巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達情況。免疫細

6、胞化學檢測細胞微管相關蛋白MAP-2的表達。研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)全骨髓貼壁篩選法獲得了純度較高(90％以上)的大鼠MSC,天然腦活素誘導分化后的細胞呈現(xiàn)雙極、多極和錐形的典型神經(jīng)元細胞的形態(tài),分別從mRNA和蛋白水平上證實誘導分化后的細胞表達神經(jīng)元標記物NSE和Nestin,不表達神經(jīng)膠質細胞標記物GFAP。誘導分化后細胞MAP-2的表達明顯。結果表明：天然腦活素可誘導MSC向神經(jīng)元樣細胞的定向分化。 4.探討天然腦活素對細胞內質網(wǎng)應激

7、(ER stress)損傷的保護作用,以期從分子基因水平闡明其抗AD作用的分子機理。以原代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞(MSC)為實驗對象,分別以衣霉素(Tm)和Aβ1-40誘導MSC模擬細胞內質網(wǎng)應激模型,應用RT-PCR、熒光免疫細胞化學、Westernblot蛋白免疫印跡技術分別檢測幫助細胞抵制應激損傷的保護性應激蛋白-內質網(wǎng)分子伴侶GRP78和GRP94,以及內質網(wǎng)膜上的促凋亡分子Caspase-12的mRNA和蛋白質的表達。結果

8、顯示:Tm或Aβ1-40干預MSC,細胞GRP78和GRP94及Caspase-12mRNA和蛋白質的表達均明顯增高(P<0.05),模擬內質網(wǎng)應激細胞模型成功；分別同時予以天然腦活素處理后,MSC細胞GRP78和GRP94 mRNA和蛋白質表達水平均明顯高于模型組細胞(P<0.05 or P<0.01),而Caspase-12 mRNA和蛋白質表達水平均較模型組細胞顯著下調(P<0.05 or P<0.01),該作用與天然腦活素呈現(xiàn)一

9、定程度的濃度依賴性。表明：天然腦活素可抑制內質網(wǎng)應激所致的細胞凋亡,對細胞內質網(wǎng)應激損傷具有明顯的保護作用。 5.探討天然腦活素對大鼠MSC和AD大鼠海馬組織基因表達譜的影響。原代培養(yǎng)了大鼠骨髓間充質干細胞(MSC),采用天然腦活素溫育細胞48h,Trizol法提取細胞總RNA,以正常培養(yǎng)的MSC細胞作對照,Affymetrix大鼠基因表達譜芯片分析天然腦活素處理組細胞基因表達譜的改變。另外,采用大鼠雙側海馬注射Aβ1-40的方

10、法復制AD動物模型,同時予以天然腦活素灌胃治療30d,檢測大鼠腦組織與體重比,Trizol法提取海馬組織總RNA,Affymetrix大鼠表達譜基因芯片分析比較假手術組、模型組和治療組大鼠海馬組織基因表達譜的變化。結果顯示：天然腦活素處理MSC細胞后,有18個基因表達明顯上調(FC>2);同時發(fā)現(xiàn)28個基因表達明顯下調(FC<-2)。動物實驗結果顯示,AD模型組海馬組織與體重比較假手術組明顯降低(P<0.05),天然腦活素治療組海馬組織

11、與體重比較模型組顯著升高(P<0.05),與假手術組無明顯差異(P>0.05)。基因芯片分析結果顯示,與假手術組相比對照,AD模型組海馬組織有58個差異明顯的基因上調,25個差異顯著的基因下調。與模型組海馬組織對照,天然腦活素治療組海馬組織出現(xiàn)15個差異顯著的基因上調,28個差異基因明顯下調。差異表達基因分別涉及包括細胞增殖、細胞分化發(fā)育、粘附、神經(jīng)生長、細胞功能調節(jié)、細胞信號轉導、物質/能量代謝、免疫應答等方面。表明：天然腦活素可在多