FK506及神經(jīng)干細胞對異體神經(jīng)移植作用的研究.pdf

1、第一部分：大鼠胚胎腦組織神經(jīng)干細胞分離、培養(yǎng)和鑒定 目的:體外無血清條件下分離、培養(yǎng)胚鼠神經(jīng)干細胞，觀察其生長及分化情況，為進行神經(jīng)干細胞移植創(chuàng)造基礎(chǔ)。 方法：通過采用機械分離和消化分離相結(jié)合的方法，取孕14～16dSD系大鼠的胚胎海馬組織，在含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代，進行神經(jīng)干細胞的單細胞克隆培養(yǎng)，顯微鏡下觀察其增殖分化過程，并對原代和傳代培養(yǎng)的細胞進行Nestin免疫熒光染色，鑒

2、定是否為神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞誘導分化后應用NSE及GFAP抗體進行鑒定。 結(jié)果：鼠腦組織中成功培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，在無血清培養(yǎng)基中細胞不斷分裂增殖，8d左右就可以形成胞體透亮、折光性好的干細胞球，細胞免疫熒光染色證實細胞系巢蛋白陽性，并能在體外傳代培養(yǎng)和連續(xù)形成克??；經(jīng)血清培養(yǎng)液誘導分化后部分呈NSE陽性，部分呈GFAP陽性?？寺〉恼T導及分化實驗表明，克隆具有多分化能力，神經(jīng)元標志物NSE、星性膠質(zhì)細胞的標志物GFAP的檢測結(jié)果

3、均呈陽性。 結(jié)論：分離和培養(yǎng)的細胞能表達神經(jīng)干細胞的特異性標志物巢蛋白，并且具有很強的增殖能力和多向分化潛能，說明新生大鼠海馬存在神經(jīng)干細胞，并可進一步用于神經(jīng)干細胞移植治療疾病的研究。 第二部分： FK506及神經(jīng)干細胞對異體神經(jīng)移植生長的作用 目的：探討FK506及神經(jīng)干細胞對異體神經(jīng)移植生長的影響。 方法：共使用50只大鼠，其中Brown-Norway（BN）大鼠10只，作為神經(jīng)移植的供體；Lewi

4、s（L）大白鼠40只，隨機分成四組，每組10只，左側(cè)坐骨神經(jīng)切斷后，造成1cm缺損，采用Brown-Norway大鼠坐骨神經(jīng)1cm移植修復；A組未施加干預因素，B組植入神經(jīng)干細胞，D組注射FK506，C組同時應用神經(jīng)干細胞及注射FK506（神經(jīng)干細胞預先用BrdU標記）。術(shù)后12周，行后肢運動及感覺評估，進行肌電圖檢查神經(jīng)傳導情況；取下組織后進行坐骨神經(jīng)組織學檢查、腓腸肌濕重測定，并采用抗體GFAP、BrdU進行免疫組織化學檢查，觀察在

5、蛋白水平變化，后進行NGF及GAP-43的原位雜交檢查，在mRNA水平檢測干預因素對異體神經(jīng)移植的作用。 結(jié)果：同時接受神經(jīng)干細胞及注射FK506組，其短期內(nèi)出現(xiàn)體重恢復慢、進食差及少動，但6周后腓腸肌濕重優(yōu)于其他組，坐骨神經(jīng)肌電圖檢查及組織形態(tài)恢復優(yōu)于單獨接受神經(jīng)干細胞或FK506組及對照組；免疫組化結(jié)果顯示：同時接受神經(jīng)干細胞及注射FK506組GFAP及BrdU表達高于其他組，移植干細胞組顯示BrdU高表達，原位雜交結(jié)果顯示