XPD通過P53抑制乙型肝炎病毒復制、HBx表達和肝癌增殖.pdf

1、第一部分：重組質粒pEGFP-N2/XPD轉染條件的優(yōu)化及Pifithr in-α孵育條件的優(yōu)化
　　 目的：
　　 本部分為探討XPD與P53兩者對HBV復制、肝癌細胞增殖凋亡以及HBx表達的影響，所以事先有必要優(yōu)化重組質粒pEGFP-N2/XPD的轉染條件和Pifithrin-α的孵育條件。
　　 方法：
　　 將HepG2.2.15細胞種植于6孔板中。種板后第2天，利用脂質體轉染法將重組質粒pEGF

2、P-N2/XPD分別按每孔0μg、2.1μg、4.0μg、6.0μg及8.0μg的濃度瞬時轉染細胞。轉染后48 h收獲細胞，進行RT-PCR和Western blot以檢測XPD表達的變化。將重組質粒pEGFP-N2/XPD以上述得出的最佳濃度轉染細胞，轉染后分別孵育0 h、24 h、48 h、72 h及96 h收獲細胞，進行RT-PCR和Westernblot以檢測XPD表達的變化。用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白報告基因表達情況。在Pi

3、fithrin-α終濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM及400μM的條件下孵育細胞12 h，然后進行MTT檢測。以上述得出的最佳濃度的Pifithrin-α分別孵育細胞0 h、12 h、24 h、36 h及48 h，然后進行MTT檢測。
　　 結果：
　　 1.質粒轉染濃度的優(yōu)化
　　 RT-PCR和Western blot結果顯示，XPD的表達在質粒濃度分別為每孔0μg、2μg、4μg范圍內呈劑量依

4、賴性升高(P<0.05)，其中4μg時XPD的表達為最高(P<0.05)。而每孔為4μg、6μg、8μg三者之間相比，XPD的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，即質粒濃度達到4μg/孔以后XPD的表達不再隨濃度的增加而繼續(xù)升高。因此，在后續(xù)的實驗中選定4μg/孔為質粒轉染的濃度。
　　 2.質粒轉染后細胞孵育時間的優(yōu)化
　　 RT-PCR結果顯示，XPD mRNA的表達在質粒轉染后細胞孵育時間分別為0h、24 h、48

5、h范圍內呈時間依賴性升高(P<0.05)，而在48 h、72 h、96 h范圍內呈時間依賴性降低(P<0.05)，其中48 h時XPD mRNA的表達為最高(P<0.05)。Western blot結果顯示，XPD蛋白的表達在質粒轉染后細胞孵育時間分別為0 h、24 h、48 h、72 h范圍內呈時間依賴性升高(P<0.05)，而在96 h時回落(P<0.05)，其中72 h時XPD蛋白的表達為最高(P<0.05)。在后續(xù)的實驗中選定4

6、8 h為質粒轉染后細胞孵育時間。
　　 3.質粒轉染成功的鑒定
　　 轉染48h后，在熒光顯微鏡下，可在轉染了重組質粒pEGFP-N2/XPD和空載質粒pEGFP-N2的細胞中觀察到綠色熒光，而未轉染質粒的細胞則未見綠色熒光，即轉染成功。
　　 4.Pifithrin-α孵育濃度的優(yōu)化
　　 MTT結果顯示，A值在Pifithrin-α濃度分別為0μM、10μM、20μM范圍內呈劑量依賴性升高(P<0.0

7、5)，其中20μM時A值為最高(P<0.05)。而濃度為20μM、30μM、40μM三者之間相比，A值無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，即Pifithrin-α濃度達到20μM以后細胞增殖活力不再隨濃度的增加而繼續(xù)升高。因此，在后續(xù)的實驗中選定20μM為Pifithrin-α的孵育濃度。
　　 5.Pifithrin-α孵育時間的優(yōu)化
　　 MTT結果顯示，A值在Pifithrin-α孵育時間分別為0 h、12 h、24 h

8、范圍內呈時間依賴性升高(P<0.05)，其中24 h時A值為最高(P<0.05)。而孵育時間為為24 h、36 h、48 h三者之間相比，A值無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，即Pifithrin-α孵育時間達到24 h以后細胞增殖活力不再隨孵育時間的增加而繼續(xù)升高。因此，在后續(xù)的實驗中選定24 h為Pifithrin-α的孵育時間。
　　 結論：
　　 本部分確定，在后續(xù)的實驗中，將以濃度為4μg/孔的pEGFP-N2/X

9、PD質粒轉染HepG2.2.15細胞，轉染后的第2天以濃度為20μM的Pifithrin-α孵育細胞24 h，轉染后共孵育細胞48 h后收獲細胞。
　　 第二部分：XPD通過P53抑制乙型肝炎病毒的復制
　　 目的：
　　 本部分研究XPD和P53兩者對HBV復制的影響。
　　 方法：
　　 將HepG2.2.15細胞種植于6孔板中。種板后第2天，利用脂質體轉染法將濃度為4μg/孔重組質粒pEGF

10、P-N2/XPD和空載質粒pEGFP-N2瞬時轉染HepG2.2.15細胞。轉染后第2天，給予20μM的Pifithrin-α孵育24 h收獲細胞。實驗分為5組：(1)空白對照組；(2)pEGFP-N2組；(3)pEGFP-N2/XPD組；(4)pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組；(5)Pifithrin-α組。用RT-PCR檢測HepG2.2.15細胞的XPD、HBsAg及HBeAg mRNA的變化；用Elisa法檢測

11、培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的含量；用熒光定量PCR法檢測培養(yǎng)上清液中HBV-DNA的含量。
　　 結果：
　　 1.XPD和P53對HBsAg、HBeAg mRNA表達的影響
　　 RT-PCR檢測發(fā)現，與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組和pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的XPD mRNA的表達明顯增多(P均<0.001)；與空白對照

12、組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組的HBsAg和HBeAg mRNA的表達明顯減少(P均<0.001)：與空白對照組相比，Pifithrin-α處理組的HBsAg和HBeAg mRNA的表達明顯增多(P均<0.05)；與轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的HBsAg和HBeAg mRNA的表達明顯增多(P均<0.001)；而空白對照組

13、與轉染空載質粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。
　　 2.XPD和P53對培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量的影響
　　 Elisa檢測發(fā)現，與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組的培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量明顯減少(P均<0.001)；與轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithri

14、n-α組的培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量明顯增多(P均<0.001)；而空白對照組、轉染空載質粒pEGFP-N2組與Pifithrin-α組三者之間相比，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。
　　 3.XPD和P53對培養(yǎng)上清液中HBV-DNA含量的影響
　　 熒光定量PCR檢測發(fā)現，與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組的培養(yǎng)上清液中HBV-DNA含量明顯減少(

15、P均<0.001)；與轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的培養(yǎng)上清液中HBV-DNA含量明顯增多(P<0.001)；而空白對照組、轉染空載質粒pEGFP-N2組與Pifithrin-α組三者之間相比，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。
　　 結論：
　　 XPD能通過P53途徑抑制HBV的復制。因此，XPD和P53可能成為乙型肝炎抗病毒治療的作用靶點。

16、　　 第三部分：XPD通過P53抑制肝癌的增殖
　　 目的：
　　 本部分研究XPD和P53兩者對肝癌細胞增殖凋亡的影響。
　　 方法：
　　 用脂質體轉染法將濃度為4μg/孔重組質粒pEGFP-N2/XPD和空載質粒pEGFP-N2轉染HepG2.2.15細胞。轉染后第2天給予濃度為20μM的Pifithrin-α孵育細胞24 h。實驗分為5組：(1)空白對照組；(2)pEGFP-N2組；(3)pEG

17、FP-N2/XPD組；(4)pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α；(5)Pifithrin-α組。用MTT法觀察細胞增殖活力；用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率。
　　 結果：
　　 1.細胞增殖活力的變化
　　 MTT結果顯示，空白對照組、pEGFP-N2組、pEGFP-N2/XPD組、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組和Pifithrin-α組的A值分別為0.655±0.136、0.

18、6334±0.119、0.114±0.055、0.528±0.076及0.934±0.201，差異有統(tǒng)計學意義(F=64.783，P<0.001)。重組質粒pEGFP-N2/XPD組的A值明顯低于空白對照組和空載質粒pEGFP-N2組(P均<0.001)；Pifithrin-α處理組的A值明顯高于空白對照組(P<0.001)；pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的A值明顯高于重組質粒pEGFP-N2/XPD組(P<0.00

19、1)；而空白對照組與空載質粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.680)。
　　 2.細胞周期的變化
　　 流式細胞儀結果顯示，空白對照組、pEGFP-N2組、pEGFP-N2/XPD組、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組和Pifithrin-α組的G1期細胞分別占總細胞數的81.15％±2.31％、80.81％±1.88％、91.08％±2.90％、79.75％±1.79％及74.78

20、％±2.01％(F=42.985，P<0.001)，G2期細胞分別占總細胞數的4.75％±1.16％、4.58％±1.07％、0.32％±0.42％、3.73％±1.76％、6.97％±0.39％(F=29.592，P<0.001)，S期細胞分別占總細胞數的14.10％±1.74％、14.61％±1.97％、8.60％±2.53％、16.52%±1.91％及18.25%±1.73％(F=19.954，P<0.001)，差異均有統(tǒng)計學意義

21、。與空白對照組和空載質粒pEGFP-N2組相比，重組質粒pEGFP-N2/XPD組的G1期細胞明顯增多(P均<0.001)，G2期和S期細胞明顯減少(P均<0.001)；與空白對照組相比，Pifithrin-α處理組的G1期細胞明顯減少(P<0.001)，G2期和S期細胞明顯增多(P均<0.01)；與重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的G1期細胞明顯減少(P<0.001)，G2期和

22、S期細胞明顯增多(P均<0.001)；而空白對照組與轉染空載質粒pEGFP-N2組之間相比，G1期細胞(P=0.794)、G2期(P=0.787)和S期細胞(P=0.662)差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 3.細胞凋亡率的變化
　　 流式細胞儀結果顯示，空白對照組、pEGFP-N2組、pEGFP-N2/XPD組、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組和Pifithrin-α組的凋亡細胞分別占總細胞數的5.72%±

23、0.64％、6.33%±1.12％、36.43％±3.12％、13.66%±2.18％及2.12％±0.80％，差異有統(tǒng)計學意義(F=341.606，P<0.001)。轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組的細胞凋亡率明顯高于空白對照組和空載質粒pEGFP-N2組(P均<0.001)；Pifithrin-α處理組的細胞凋亡率明顯低于空白對照組(P=0.002)；pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的細胞凋亡率明顯低于轉染重

24、組質粒pEGFP-N2/XPD組(P<0.001)；而空白對照組與轉染空載質粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.570)。
　　 結論
　　 XPD抑制肝癌細胞生長和促進肝癌細胞凋亡的作用是通過P53途徑實現的。
　　 第四部分：XPD通過P53抑制HBx的表達
　　 目的：
　　 本部分研究XPD和P53兩者對HBx、P21、Bax、Bc1-2基因表達的影響。
　　

25、方法：
　　 用脂質體轉染法將濃度為4μg/孔重組質粒pEGFP-N2/XPD和空載質粒pEGFP-N2轉染HepG2.2.15細胞。轉染后第2天給予濃度為20μM的Pifithrin-α孵育細胞24 h。實驗分為5組：(1)空白對照組；(2)pEGFP-N2組；(3)pEGFP-N2/XPD組；(4)pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組；(5)Pifithrin-α組。用RT-PCR檢測XPD、HBx、P21、B

26、ax和Bc1-2表達量的變化；用Western blot檢測XPD、P53、p-P53(ser-15)、HBx、P21、Bax和Bc1-2表達量的變化。
　　 結果：
　　 1.XPD、HBx、P21、Bax和Bc1-2 mRNA表達的變化
　　 RT-PCR檢測發(fā)現，pEGFP-N2/XPD的轉染明顯增加了XPD mRNA的表達(P<0.001)；與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒p

27、EGFP-N2/XPD組的P21和Bax mRNA的表達明顯增多，而Bc1-2和HBx mRNA的表達明顯減少(P均<0.001)；與空白對照組相比，Pifithrin-α處理組的P21和Bax mRNA的表達明顯減少，而Bc1-2和HBx mRNA的表達明顯增多(P均<0.01)；與轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的P21和Bax mRNA的表達明顯減少，而Bc1-2和HB

28、x mRNA的表達明顯增多(P均<0.001)；空白對照組與轉染空載質粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。
　　 2.XPD、P53、p-P53(ser-15)、HBx、P21、Bax和Bc1-2蛋白表達的變化
　　 Western blot檢測發(fā)現，pEGFP-N2/XPD的轉染明顯增加了XPD蛋白的表達(P<0.001)；與空白對照組和轉染空載質粒pEGFP-N2組相比，轉染重組質粒pE

29、GFP-N2/XPD組的P53、p-P53(ser-15)、P21和Bax蛋白的表達明顯增多，而Bc1-2和HBx蛋白的表達明顯減少(P均<0.01)；與空白對照組相比，Pifithrin-α處理組的P53、P21和Bax蛋白的表達明顯減少，而Bc1-2和HBx蛋白的表達明顯增多(P均<0.05)，但是p-P53(ser-15)的表達卻無明顯區(qū)別(P=0.909)；與轉染重組質粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+

30、Pifithrin-α組的P53、p-P53(ser-15)、P21和Bax蛋白的表達明顯減少，而Bc1-2和HBx蛋白的表達明顯增多(P均<0.001)；空白對照組與轉染空載質粒pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。
　　 結論：
　　 XPD能通過P53途徑上調P21和Bax的表達并下調HBx和Bc1-2的表達。同時也表明，XPD、P53和HBx三者之間能相互作用、相互影響，共同調節(jié)肝癌的發(fā)