中性粒細胞極性化中TRPC1蛋白分子轉(zhuǎn)位及脂筏的激光共聚焦研究.pdf

1、研究背景：
　　 極性是真核細胞的基本生物學特征。細胞極性(cen polarity)對正常的細胞分化、細胞遷移、細胞質(zhì)分裂以及組織、器官的形成等眾多生物學過程起著關(guān)鍵性的作用。細胞極性是指細胞為了行使特殊的生理功能或產(chǎn)生定向的分化,在胞內(nèi)的信號分子不對稱分布致使細胞在表型上產(chǎn)生不對稱性。具體表現(xiàn)在細胞形狀、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)不對稱分布,細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)。極性細胞特征性變化是細胞內(nèi)必須的細胞骨架分子在細胞前極形成一個富含絲

2、狀肌動蛋白的片狀偽足,而在后極形成尾足:細胞極化參與諸如營養(yǎng)物質(zhì)獲取、酵母繁殖、傷口修復(fù)、軸突生長、血管發(fā)生、胚胎發(fā)育、原生動物多細胞結(jié)構(gòu)的形成和機體發(fā)育過程中細胞的遷移功能,所以目前將極性和生長、發(fā)育等并列為細胞的基本功能。
　　 中性粒細胞生理學的發(fā)揮功能有賴于極性的形成。臨床上多種疾病如敗血癥、哮喘、缺血/再灌注損傷和器官移植產(chǎn)生的排斥反應(yīng)、類風濕性關(guān)節(jié)炎及一些由于感染引起的器官衰竭反應(yīng)都與中性粒細胞極性功能的增強或減弱相

3、關(guān)。中性粒細胞是機體遭受外來細菌和其他病原體入侵時機體的第一道防線,而這種作用是建立在中性粒細胞極性和趨化性基礎(chǔ)上的。在各種趨化物的作用下,中性粒細胞憑借胞內(nèi)分子對極化信號的優(yōu)化和放大,能夠準確確定炎癥部位并使其自身發(fā)生極性改變,最終向炎癥部位發(fā)生定向移動,而中性粒細胞極性化是其定向遷移的前提條件。
　　 多種分子參與趨化劑刺激導(dǎo)致的中性粒細胞極性化過程,近年來研究胞內(nèi)Ca2+濃度和分布的變化也涉及其中。中性粒細胞趨化劑甲酰甲硫

4、氨酰.亮氨酰.苯丙氨酸(fMLP)可以通過G蛋白偶聯(lián)受體進而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IP3受體從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫的釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫釋放可以激活SOCE通路,促進細胞外鈣的內(nèi)流。在中性粒細胞的研究中發(fā)現(xiàn),中性粒細胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度的升高是其活化的必要條件,因而可通過SOC抑制劑來抑制中性粒細胞活性。TRPC可被胞內(nèi)鈣離子濃度激活,被認為是最可能的鈣庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ)。但TRPC1作為SOC的主要候選分子是否參與中

5、性粒細胞極性化過程以及在此過程中起何種作用,阻斷TRPC1后對中性粒細胞極性化過程以及趨化性有何影響,尚無確切報道。
　　 TRPC1在細胞極性化過程中可能起著重要的作用,而且這種作用可能與胞膜上存在的一類特殊脂質(zhì)結(jié)構(gòu)-脂筏(Lipid raft)存在密切的關(guān)系,其關(guān)鍵功能是它是一個信號的平臺。為了進一步理解TRPC1和脂筏的關(guān)系,我們觀察了mDCD(甲基-β-環(huán)糊精,Methyl-β-cyclodextrin)對中性粒細胞極性

6、的影響。mβCD能夠清空中性粒細胞膽固醇,破壞脂筏完整性,從而可能影響到極性的形成過程。
　　 由于使中性粒細胞發(fā)生極性的各種機制之間的關(guān)系復(fù)雜又密切,尤其是SOCE機制的主要候選分子TRPC1在極化過程中的作用,以及其與脂筏的相互關(guān)系有待于進一步研究與探討。
　　 目的：
　　 本實驗通過使用均一、低濃度的fMLP作用于中性粒細胞建立細胞極性模型。通過觀察TRPCI通道蛋白分子的轉(zhuǎn)位；以及應(yīng)用TRPC通道抑制劑

7、(SK&F96365、2-APB)和破壞脂筏結(jié)構(gòu)的特異藥物(mβCD)預(yù)處理中性粒細胞進而觀察對極性分子F-actin的影響以及對細胞極性的影響,從而探討TRPC1在中性粒細胞極性化過程中的作用以及和脂筏的關(guān)系。
　　 方法
　　 1.采用Dextran沉降法、標準的梯度密度離心和紅細胞裂解的方法分離人血中性粒細胞,進行瑞氏.吉姆薩染色和臺盼藍染色分析細胞純度和細胞活力。
　　 2.應(yīng)用免疫熒光方法檢測聚合F-a

8、ctin,TRPC1和脂筏在人中性粒細胞內(nèi)的分布。
　　 3.應(yīng)用免疫熒光方法檢測聚合F-actin,TRPC1和脂筏在dHL-60細胞內(nèi)的分布。
　　 結(jié)果
　　 1.中性粒細胞分離后,對細胞進行臺盼藍染色,細胞的活性大于98％,瑞氏-姬姆薩染色,細胞純度大于95％。
　　 2.在fMLP誘導(dǎo)的細胞極性過程中TRPC1蛋白分子、F-actin極性分子以及脂筏均發(fā)生極性分布；
　　 3.使用TRP