棉花GhMYBL基因克隆和初步表達分析.pdf

1、我國是重要的產(chǎn)棉大國和紡織品出口國，棉花在我國國民經(jīng)濟中占有十分重要的地位，提高棉花的產(chǎn)量和品質對我國民生意義重大，同時也是棉花育種的主要目標。傳統(tǒng)育種方法難以達到產(chǎn)量和品質的同步提高。利用基因工程方法可以打破物種間的遺傳障礙，實現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉移，且后代易于穩(wěn)定，育種周期短，為進一步改善棉花的產(chǎn)量和品質提供了一條有效的途徑。利用基因工程改良棉花的產(chǎn)量和品質，首先必須清楚棉花生殖發(fā)育過程的分子機制。因此，分離與棉花生殖發(fā)育相關基因

2、，分析基因功能和解析棉花生殖發(fā)育的分子機制對改良棉花產(chǎn)量和品質具有重要的理論意義和實踐價值。 轉錄因子參與調控植物生長發(fā)育、形態(tài)建成以及代謝調控等各個方面，研究工作表明，它們在植物的發(fā)育調控中起重要作用，因此研究轉錄因子在植物發(fā)育調控領域的功能作用意義重大(Martin C．，1996)。MYB轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族，功能也最多樣化。目前棉花中關于MYB轉錄因子的研究大多集中在棉纖維這一領域，在其它方面的研究，尤其在

3、與棉花生殖發(fā)育密切相關的花藥這一塊的研究，鮮見報道。因此，加快棉花花藥中MYB轉錄因子這一領域的研究有很現(xiàn)實的意義。 我們從棉花幼花cDNA文庫中分離克隆了30個轉錄因子的基因。通過生物信息學方法以及表達模式的分析，我們從中挑選了一個與MYB蛋白具有同源性、在花藥中特異表達的轉錄因子作為我們進一步研究的對象，并命名為GhMYBL。我們對該基因進行了分子克隆和表達模式分析，并利用棉花的遺傳轉化分析該基因功能，以此深化對棉花MYB基

4、因的結構、保守性、相關功能以及表達調控的認識。主要結果如下： 1．棉花GhMTBL的分離鑒定通過生物信息學方法，我們將在棉花幼花cDNA文庫中分離得到的30個轉錄因子基因與基因庫中的其它基因進行比較和同源性分析；同時，利用實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法進行表達模式分析。結合這兩個方面的數(shù)據(jù)，我們從中挑選出一個在棉花花藥中特異表達的MYB基因，并命名為GhMYBL。序列分析表明，GhMYBL編碼一個含有210個氨基酸的蛋白

5、質，包含有兩個MYB結構域，屬于R2R3-MYB亞類。RT-PCR結果顯示GhMYBL在花藥組織中特異表達，因而推測GhMYBL與花藥的發(fā)育相關。 2．棉花GhMYBL在花藥中特異表達用改良的熱酚法提取棉花發(fā)育早期各組織的RNA，反轉錄為cDNA，利用RT-PCR的方法對30個棉花轉錄因子基因的進行表達模式分析，從中篩選出在棉花花藥中特異表達的轉錄因子基因GhMYBL。然后，提取棉花不同組織不同時期的RNA，經(jīng)轉膜后，做Nort

6、hern雜交分析。Northern雜交結果顯示GhMYBL在棉花花藥中表達量最高，在花瓣中微量表達，而在其它組織中沒有檢測到此基因的表達，其結果與RT-PCR結果相一致，進一步說明GhMYBL基因是組織特異性表達，與花藥組織的發(fā)育相關。 3．載體的構建和棉花轉化利用DNA重組技術，將GhMYBL基因克隆到pBI121質粒中，分別構建了過量表達載體(overexpression vector)和RNAi(supression ve