Caveolin-1調控頭頸鱗癌侵襲轉移的分子機制研究.pdf

1、腫瘤轉移是一個復雜而且有多步驟參與的過程。近年來研究表明：上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與上皮源性腫瘤轉移過程密切相關，并且TGF-β1介導的信號通路在惡性腫瘤細胞EMT中發(fā)揮了十分重要的作用，如果能找到一種關鍵基因調控TGF-βi介導的信號通路，阻止EMT形成，將可能有效地控制惡性腫瘤的轉移。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：Caveolin-1在頭頸鱗癌轉移中發(fā)揮了重要作用。為了探討Ca

2、veolin-1在頭頸鱗癌細胞轉移中的作用及其調控的分子機制，本課題首先制備了慢病毒介導的過表達和Caveolin-1干擾的重組慢病毒；利用Caveolin-1干擾慢病毒下調人頭頸鱗癌細胞株Tu686中Caveolin-1的表達，通過體外實驗觀察它對細胞生長以及表型的影響；并通過活化TGF-β1信號通路后，分別上調、下調Caveolin-1的表達，對Caveolin-1調控TGF-β1信號通路在頭頸鱗癌細胞EMT及侵襲轉移的作用機制進行

3、探討，從而為頭頸鱗癌轉移發(fā)生的機制研究提供實驗依據(jù)。本研究分為以下三部分：
　　 第一部分 Caveolin-1過表達和干擾慢病毒載體的構建
　　 目的：構建Caveolin-1過表達和Caveolin-1干擾慢病毒載體
　　 方法：利用引物擴增Caveolin-1 cDNA和線上設計合成針對Caveolin-1靶基因的干擾序列shRNA；將二者分別與病毒載體連接，將載體轉化大腸桿菌并鑒定陽性克隆，證實載體構建成

4、功；利用慢病毒包裝試劑盒將包含Caveolin-1過表達和干擾cDNA序列的病毒載體和包裝載體共感染包裝細胞，經(jīng)回收、純化得到Caveolin-1過表達和干擾的重組慢病毒。
　　 結果：測序結果證明：包含Caveolin-1cDNA過表達和干擾序列的慢病毒載體構建成功，得到Caveolin-1過表達和干擾重組慢病毒。
　　 第二部分沉默Caveolin-1基因對頭頸鱗癌細胞生長凋亡、上皮-間質轉化以及遷移侵襲能力的影響<

5、br>　　 目的：觀察沉默Caveolin-1基因對頭頸鱗癌細胞表型及生物學行為的影響
　　 方法：用慢病毒Caveolin-1 shRNA感染Tu686細胞，經(jīng)篩選獲得Caveolin-1基因沉默的穩(wěn)轉細胞；并用半定量PCR、Weatern-blot檢測Caveolin-1 mRNA和蛋白表達變化；CCK8檢測細胞生長增殖能力、流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的情況；顯微鏡下觀察細胞表型形態(tài)的變化；Western-blot檢測細

6、胞表型相關蛋白E-cadherin、Vimentin的變化；劃痕愈合實驗及Transwell小室實驗檢測細胞遷移侵襲能力的變化。
　　 結果：慢病毒質粒干擾Tu686細胞后，證實重組慢病毒Caveolin-1 shRNA感染效率高達90％以上；篩選出Tu686Caveolin－1 RNAi＋基因沉默細胞株和Tu686Caveolin－1 RNAi－陰性對照細胞株；CCK8和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)實驗組細胞的生長及凋亡情況與對照組細胞

7、相比沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；顯微鏡下觀察實驗組細胞呈梭形，細胞有偽足伸出，細胞間隙增寬；Western-blot結果顯示實驗組細胞較陰性對照細胞上皮性標志物E-cadherin蛋白水平明顯下調，間質性標志物Vimentin蛋白表達水平明顯上調：劃痕愈合實驗顯示實驗組細胞較陰性對照細胞的遷移能力明顯增強，24小時劃痕愈合率分別為(55.50±5.6)％、(24.20±2.5)％(P＜0.05)；Transwell小室實驗結果顯示實

8、驗組細胞較陰性對照細胞的侵襲能力明顯增強，48小時穿過基底膜細胞數(shù)分別為103±15、34±4(P＜0.05)。
　　 第三部分 Caveolin-1調控 TGF-β1信號通路對頭頸鱗癌細胞侵襲能力的影響
　　 目的：觀察Caveolin-1對TGF-β1信號通路的調控作用及頭頸鱗癌細胞侵襲遷移能力的影響
　　 方法：利用細胞免疫熒光技術在Tu686細胞中進行免疫細胞雙染，檢測TGF-βRⅠ與Caveolin-1

9、在細胞內定位情況；Western-blot檢測沉默Caveolin-1基因實驗組和陰性對照組細胞中TGF-β1下游蛋白分子Smad2和其磷酸化產(chǎn)物p-Smad2的表達的表達；TGF-β1刺激Tu686細胞48小后，利用Caveolin-1過表達慢病毒感染細胞，Western-blot檢測Caveolin-1基因表達以及對TGF-β1信號通路下游蛋白表達的變化情況，Transwell小室實驗檢測細胞侵襲遷移能力的變化。
　　 結果

10、：細胞免疫熒光雙染結果顯示：TGF-β1受體TGF-βRⅠ與Caveolin-1共定位于Tu686細胞膜上；沉默Caveolin-1基因實驗組細胞中p-Smad2的表達較陰性對照組細胞明顯上調(P＜0.05)，而總Smad2的表達并沒有明顯的變化(P＞0.05)；隨著TGF-β1劑量的增加，Tu686細胞Caveolin-1的表達逐漸下調(P＜0.05)，p-Smad2的表達則逐漸上調(P＜0.05)，而總的Smad2的表達沒有明顯變化

11、(P＞0.05)；Caveolin-1過表達慢病毒Caveolin-1 cDNA感染TGF-β1活化Tu686細胞后，細胞中p-Smad2的表達顯著下調(P＜0.05)，而總的Smad2的表達無明顯變化(P＞0.05)，侵襲轉移能力顯著下降(P＜0.05)。本研究得出如下結論：
　　 1.Caveolin-1對頭頸鱗癌細胞生長增殖、細胞周期和凋亡沒有明顯的影響；
　　 2.Caveolin-1可以誘導頭頸鱗癌細胞發(fā)生上皮