大腸桿菌表達片球菌素的純化工藝及其理化特性的研究.pdf

1、本實驗室已將乳酸片球菌素pedA基因與pMD18-T載體和表達質粒pET32a(+)連接所構成的重組質粒轉化到E.coli BL21(DE3)基因工程菌中,構成了用大腸桿菌表達片球菌素的表達系統(tǒng)。本研究旨在研究在E.coli BL21(DE3)基因工程菌表達片球菌素的分離純化和理化性質。
　　 本研究對兩種誘導方法誘導E.coli BL21(DE3)基因工程菌表達片球菌融合蛋白——使用IPTG誘導和使用ZYM-5052培養(yǎng)基自動

2、誘導進行了比較,結果表明使用ZYM-5052培養(yǎng)基自動誘導的表達效果優(yōu)于IPTG誘導,自動誘導最終菌液的OD600在7左右,而IPTG誘導只有3左右,產生的包涵體蛋白在相同條件下溶解,自動誘導的蛋白濃度為0.2359mg／ml,而IPTG誘導只有0.1001mg／ml。
　　 由于E.coli BL21(DE3)基因工程菌的高效表達,所形成的片球菌素融合蛋白的形式為包涵體,為了獲得具有活性的基因工程片球菌素,本研究對包涵體的提取

3、、溶解、和多種復性方法,包括稀釋復性、反稀釋復性、透析復性、CTAB輔助復性和CTAB和β-CD結合輔助復性等方法進行了研究。實驗結果表明,CTAB和βp—CD結合輔助復性的復性方法優(yōu)于其它的復性方法,可以實現(xiàn)較高的初始變性蛋白濃度,較小的復性液體積和達到相對穩(wěn)定的復性率。為了實現(xiàn)基因工程片球菌素的分離純化,將復性后并濃縮到一定體積基因工程片球菌素在腸激酶緩沖液中用腸激酶處理,可以實現(xiàn)基因工程片球菌素和硫氧還蛋白的分離,基因工程片球菌素

4、帶有His標簽,將酶切后蛋白溶液注入Ni-MDA親和重力柱,在500mmol／L咪唑的條件下可以被洗脫下來。洗脫的最高蛋白濃度達到0.014mg／ml。
　　 本研究對基因工程片球菌素的抑菌活性和部分理化性質如熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性、酶敏感性進行了分析。結果表明基因工程片球菌素對植物乳桿菌,單核細胞增多癥李氏桿菌有抑菌作用。基因工程片球菌素的熱穩(wěn)定性較好,經121℃高壓處理后仍顯示出部分抑菌活性,在pH值1-7范圍內活性穩(wěn)定,pH