小間隙吻合法聯(lián)合BMSCs移植修復周圍神經(jīng)斷裂的實驗研究.pdf

1、第一部分：SD大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定及凍存復蘇
　　目的：掌握SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和擴增的方法，并探討其生物學特性。
　　方法：無菌條件下取出SD大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，用含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，收集細胞，離心，去上清，重懸，計數(shù)后，置于含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2環(huán)境下進行培養(yǎng)，應用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進行純化。待細胞達90％融合時，胰酶消

2、化2-3min后進行傳代。倒置顯微鏡下觀察原代及傳代后的細胞生長特點。計數(shù)板計數(shù)法測定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的生長曲線，從而進一步了解其生長特性。通過流式細胞儀進行細胞鑒定。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)顯示24h后即可看到有少許細胞貼壁，剛貼壁的BMSCs仍保持圓形，48h貼壁細胞增多，開始呈現(xiàn)成纖維細胞樣形態(tài)，伸突，呈短梭形、三角或多角形。最初2～5天細胞增殖較慢，呈克隆樣生長，細胞向四周伸展。第6-9天時細胞集落迅速增多，呈旋渦狀，并向

3、周圍不斷擴大，原代培養(yǎng)12-15天，細胞80～90％融合，即可以傳代。一般情況下傳至第4、5代可獲得形態(tài)均一、增長旺盛的BMSCs純化細胞。P2、P4、P6細胞生長曲線基本相同，分為潛伏期(第1-2天)、對數(shù)生長期(第3-5天)和平臺期(第6-7天)，且?guī)状毎g生長狀況穩(wěn)定。取生長狀態(tài)良好的第5代BMSCs，應用流式細胞儀進行表面抗原標志物鑒定的結(jié)果顯示：CD90(99.8％)、CD29（93.7%）陽性，CD34(0.8％)、CD4

4、5(1.3％)陰性。
　　結(jié)論：
　　1、全骨髓培養(yǎng)結(jié)合貼壁分離法能夠在體外簡單、快速的分離、純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，并使其能在體外迅速得到增殖。
　　2、采用全骨髓培養(yǎng)結(jié)合貼壁分離法分離培養(yǎng)的BMSCs性狀穩(wěn)定，操作簡單實用，為BMSCs的進一步實驗研究提供了良好的細胞模型。
　　第二部分自體神經(jīng)外膜小間隙吻合法構(gòu)建的神經(jīng)再生室內(nèi)植入BMSCs修復周圍神經(jīng)斷裂的實驗研究
　　目的：設(shè)計自體神經(jīng)外膜小

5、間隙吻合法構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)再生室模型，并通過植入骨髓間充質(zhì)干細胞改變神經(jīng)再生室的微環(huán)境，觀察其對損傷神經(jīng)的再生和修復作用。
　　方法：采用健康雄性清潔級SD大鼠32只，隨機分成2組，對照組（L-DMEM組）16只，實驗組（BMSCs組）16只。各組大鼠左下肢坐骨神經(jīng)銳刀切斷后，均行自體神經(jīng)外膜小間隙吻合法修復。對照組神經(jīng)再生室內(nèi)注入50ul不含BMSCs的L-DMEM培養(yǎng)液，即L-DMEM組。實驗組神經(jīng)再生室內(nèi)注入50ul含BMS

6、Cs的培養(yǎng)液。通過一般狀態(tài)、光鏡下大體形態(tài)、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、運動神經(jīng)傳導速度、組織學和免疫組織化學、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察比較兩組大鼠神經(jīng)再生和功能恢復情況。
　　結(jié)果：術(shù)后4周免疫組織化學染色觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組術(shù)后4周可見較多BrdU陽性細胞，對照組無BrdU陽性細胞，表明BMSCs能夠在局部神經(jīng)再生室內(nèi)存活并發(fā)揮修復作用。術(shù)后12周時，本實驗形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)局部神經(jīng)再生室內(nèi)植入BMSCs的實驗組相比于未植入BMSCs的對照組周圍

7、組織粘連較輕，神經(jīng)纖維較規(guī)則，結(jié)締組織增生不明顯，雪旺氏細胞增生明顯，數(shù)量較多，再生神經(jīng)軸突和髓鞘較為成熟。功能學指標大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)結(jié)果顯示4周到12周SFI逐漸恢復。經(jīng)統(tǒng)計學分析，術(shù)后4周、8周、12周，實驗組SFI恢復優(yōu)于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。神經(jīng)電生理檢測顯示實驗組的坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)傳導速度高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、自體神經(jīng)外膜小間隙吻合法聯(lián)合BM