枯否細胞分離培養(yǎng)及其在同種肝移植免疫中作用機制初步探討.pdf

1、第一部分:大鼠及人肝臟枯否細胞的分離純化和培養(yǎng)
　　目的:
　　改進大鼠肝枯否細胞(kupffer cell,KC)分離、純化和培養(yǎng)技術,探討從人體肝臟手術標本中分離、純化和培養(yǎng)枯否細胞的可行有效方法,以便進一步研究人體枯否細胞的生物學功能。
　　方法:
　　24只SD大鼠肝臟及6例人體肝臟手術標本用于本實驗。大鼠肝臟通過門靜脈、人體肝組織通過肝靜脈灌注預灌流液,灌注后肝臟標本采用離體膠原酶灌注消化獲得細胞懸液,

2、然后通過差速離心去除細胞懸液中的肝實質細胞,獲得富含KC的肝非實質細胞。改傳統(tǒng)PBS重懸肝非實質細胞為25％percoll重懸,從而形成新percoll梯度為:PBS、含肝非實質細胞的25%percoll、50% percoll,然后通過不連續(xù)密度梯度離心分離獲得枯否細胞,最后選擇性貼壁進一步純化。應用吞噬功能實驗對KC進行鑒定,臺盼藍拒染實驗判定細胞活力。
　　結果:
　　最終獲得的枯否細胞的產量分別為:大鼠3.1±0.5

3、×106/g肝臟,人體肝臟組織為2.3±0.4×106/g肝臟,細胞活力和純度均達90%。
　　結論:
　　本實驗建立的大鼠及人體肝臟枯否細胞分離方法,簡便經濟,效果穩(wěn)定,獲得的枯否細胞可用于進一步的實驗研究。
　　第二部分:人枯否細胞在同種肝移植免疫中作用機制初步探討目的:
　　通過將枯否細胞和/或同種異體混合淋巴細胞直接接觸共培養(yǎng),觀察共培養(yǎng)細胞KC和PBMC表面HLA-G蛋白表達,測定培養(yǎng)上清液中一氧化氮和

4、細胞因子的變化,觀察KC對淋巴細胞增殖的影響,探討枯否細胞在共培養(yǎng)體系中的作用及機制,試圖了解枯否細胞在肝移植免疫耐受中的功能作用,為進一步利用枯否細胞特異性誘導肝移植耐受的實驗與臨床研究提供依據(jù)。
　　方法:
　　分離健康志愿者及接受肝臟手術者的外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC,分別記為Pr及Pd),各6例。將枯否細胞和/或異體混合淋巴細胞共培養(yǎng)作為實驗組,包

5、括:PP組,即Pr+Pd;KP組,即Kc+Pr;KPP組,即Kc+Pr+Pd,將單獨Pr,Pd,Kc及Kc+Pd培養(yǎng)組作為對照組。其中24孔板培養(yǎng)組用于收集細胞和培養(yǎng)上清液,96孔板培養(yǎng)組用于 MTT實驗。分別于培養(yǎng)后第1、2、4、6天收集細胞上清液,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩５?天培養(yǎng)結束時分別收獲培養(yǎng)的枯否細胞和外周血單個核細胞。應用免疫組織化學技術檢測HLA-G在枯否細胞和單個核細胞表面的表達;應用硝酸還原酶法測定上清液中NO的濃

6、度,用雙抗體夾心 ABC-ELISA技術測定上清液中干擾素-γ、白介素-10和轉化生長因子-β1的濃度;用MTT法測定PP組及KPP組中淋巴細胞增殖。
　　應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗結果以均數(shù)±標準差( x± S)表示,組間比較采用單向方差分析法(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用SNK(Student-Newman-keuls)-q檢驗,以p<0.05為具有顯著性差異統(tǒng)計學標準。
　　結

7、果:
　　1、在培養(yǎng)第6天,實驗組及對照組中枯否細胞和外周血單個核細胞表面均未檢測到HLA-G的表達。
　　2、含枯否細胞的混合培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)上清液中,NO的產量顯著上升,且在任一相同時間點,KPP組顯著高于KP組(P<0.01),并且均在第4天達峰值, PP組也呈相同變化趨勢,但均低于同時點的KPP組、KP組產量(P<0.01),對照組中僅 Kc,Kc+Pd組檢測到 NO的少量分泌。在第1、2天兩個時間點,KPP組中IFN

8、-γ的含量高于PP組而在隨后兩個時間點,PP組中IFN-γ值均高于同時點的KPP組和KP組,該三組中IFN-γ的變化趨勢相似,均在第4天達最高值,隨后下降。對照組中未能檢測到IFN-γ的表達。PP實驗組細胞培養(yǎng)上清夜中第1天未能檢測到IL-10,在以后三個時間點分泌呈持續(xù)上升趨勢,在第6天時達7.714±2.651pg/ml,而在KPP組和KP組中,IL-10呈相對強勢分泌,KP組顯著高于KPP組(P<0.01),在第4天達峰值隨后降低

9、,但KPP組仍呈上升趨勢。對照組中未能檢測到IL-10的表達。在三個實驗組中,轉化生長因子-β1(TGF-β1)的含量呈持續(xù)上升趨勢,至第6天時仍在升高,且在任一同時間點,KP組中TGF-β1的含量均高于KPP組及PP組(P<0.01),且PP組與KPP組比較,差異也有顯著性,PP組在第1天時未能檢測到TGF-β1。對照組中僅Kc,Kc+Pd組檢測到TGF-β1的少量分泌。MTT實驗發(fā)現(xiàn),KPP組中OD值顯著低于PP組(P<0.05)。