R-Ras基因在胰腺癌發(fā)病過程中的作用及其對信息通路影響的初步探討.pdf

1、目的:胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一。因早期無特異表現,大多數的胰腺癌患者在就診時已有局部的擴散和轉移。盡管現在手術切除率有很大提高,但預后仍很差。故當務之急是要深入研究與胰腺癌密切相關的基因表達譜的改變,找出與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物學特性、治療敏感性及不同預后有關基因,以指導其早期診斷、癌癥特征分析和預后判斷。近年來ras基因突變與胰腺癌的關系引起較高的關注。其中K-ras基因與胰腺癌的關系得到了廣泛研究,而對于R-ras在胰腺癌

2、中的表達研究,目前尚未見報道。本研究旨在了解人胰腺癌組織中R-ras的表達情況及其與胰腺癌組織分化程度的關系,并初步探討R-Ras基因在胰腺癌發(fā)病過程中的作用及其機制。方法:采用免疫組織化學法檢測67例人胰腺癌與癌旁組織中R-ras蛋白表達水平并同P21 ras與PCNA的表達情況進行比較,陽性對照為已知陽性的胰腺癌切片,空白對照為已知陽性的胰腺癌切片,不加二抗,以PBS代替。光鏡下觀察以細胞漿或細胞核內出現棕黃色細顆粒為陽性,采用雙盲

3、法計數1000個癌細胞,按陽性細胞所占百分比確定:陽性細胞數<5％為陰性(-),陽性細胞數5%~24%為弱陽性(+),陽性細胞數25%~50%為中度陽性(++),陽性細胞數>50%為強陽性(+++)。計算陽性率時將陽性細胞數≥5%統一計為陽性。所有數據采用SPSS10.0軟件包進行統計學分析。率的比較采用卡方檢驗,組間比較采用秩和檢驗,等級分組資料比較采用Ridit法,用Spearman方法進行相關性分析,規(guī)定P<0.05為差異有統計學

4、意義。設計合成引物,高保真PCR法擴增R-ras全長序列,構建pcDNA3.1(+)-R-Ras重組質粒并擴大培養(yǎng);采用Lipofectamine2000脂質體轉染方法,將上述重組質粒轉染至panc-1胰腺癌細胞,采用MTS法進行細胞增殖檢測。并采用Corning公司的Transwell體外侵襲方法檢測轉染至上述重組質粒后panc-1胰腺癌細胞的體外侵襲能力改變情況。用western法分析panc-1胰腺癌細胞轉染pcDNA3.1(+)

5、-R-Ras重組質粒后MAPK通路中Erk1/2,p38和JNK/SAPK的改變;并檢測JNK抑制劑SP600125對轉染后panc-1胰腺癌細胞體外細胞增殖影響。結果:1.R-ras蛋白在原發(fā)性胰腺癌中表達水平升高免疫組織化學檢測表明R-ras、P21ras及PCNA在原發(fā)性胰腺癌中陽性表達率明顯高于癌旁組織中相應陽性表達率,其差異有統計學意義。按分化程度分組比較R-ras蛋白在胰腺癌中陽性表達率高于相應癌旁組織中陽性表達率,均P=0

6、.000;胰腺癌組織中R-ras蛋白陽性表達率在不同分化程度的各組間比較差異無統計學意義(X~2=0.664,P=0.717);胰腺癌組織中R-ras陽性表達水平在不同分化程度的各組間比較差異也無統計學意義(X~2=1.4674,P=0.480,Ridit test)。2.R-Ras促進細胞增殖為探討R-Ras對細胞增殖的影響,我們分別將pcDNA3.1(+)-R-Ras和pcDNA3.1(+)空載體瞬時轉染經同步化的胰腺癌細胞系,48

7、h后用MTS測定細胞增殖情況。結果表明與空白組細胞和轉染pcDNA3.1(+)空載體細胞相比,轉染R-Ras后細胞增殖加快(P<0.05,ANOVA)。提示R-Ras能夠促進胰腺癌細胞的增殖。3.R-Ras通過JNK途徑促進細胞增殖為分析R-Ras促進細胞的作用機制,我們進一步分析了MAPK通路中Erk1/2,p38和JNK/SAPK的改變,發(fā)現轉染R-Ras后主要是激活了JNK的活性,用JNK特異性抑制劑10 nM SP600125抑

8、制JNK的活性后,顯著抑制了胰腺癌細胞的增殖。4.表達R-Ras并不提高細胞的侵襲力為分析胰腺癌細胞在其JNK途徑被激活后對細胞生物學效應的影響。我們用Transwell的方法分別比較分析了轉染R-Ras細胞在體外侵襲能力的改變。結果示轉染R-Ras細胞無論在有或無血清下,均不明顯改變其體外侵襲能力。(P>0.05,ANOVA)。提示胰腺癌細胞表達R-Ras可能不增加其侵襲性。結論:1.R-ras基因在原發(fā)性胰腺癌中表達增加,但R-ra