SARA在糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉分化中的作用與分子機制.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是終末期腎臟疾病(Endstage renal disease，ESRD)最常見的原因之一。腎小管間質纖維化(Tubulointerstitial fibrosis，TIF)是糖尿病腎病發(fā)展到ESRD的最主要病理改變。腎小管上皮細胞轉分化(Epithelial to mesenchymaltransition，EMT)是腎間質纖維化的早期且可逆階段，細

2、胞外基質(Extracellular matrix，ECM)沉積是腎間質纖維化的主要組織學改變。研究表明高糖可導致腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積，而轉化生長因子-β1(Transforming growth factor, TGF-β1)在這一過程中起關鍵作用。TGF-β1/Smads信號通路是TGF-β1誘導EMT及ECM沉積的主要途徑，受多個因素的調控。
　　 Smad錨著蛋白(Smad anchor for recept

3、or activation，SARA)是TGF-β/Smad信號通路的銜接蛋白(Adaptor protein)。SARA可呈遞Smad2和Smad3至活化的TGF-βⅠ型受體(Tβ I R)，促進其磷酸化，介導TGF-β1信號由其受體活化到核轉位的過程。SARA是Smad2磷酸化及核轉位的關鍵因子，而Smad3的活化不依賴于SARA。研究顯示SARA與EMT及纖維化呈負相關，靶向SARA的干預策略能夠逆轉EMT?；谝陨戏治?，我們認為

4、SARA可能與糖尿病腎病腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積有關，為此，本實驗開展如下的研究。
　　 目的：觀察糖尿病腎病患者腎組織中SAA的表達，初步探討SARA與糖尿病腎病腎間質纖維化的關系。
　　 方法：隨機選取經(jīng)臨床和腎臟病理確診為糖尿病腎病及微小病變患者(原發(fā)性腎病)各6人。采用HE、Masson、PASM染色觀察腎臟普通病理改變并評價腎間質損傷和膠原沉積程度；免疫組化檢測腎臟組織SARA表達變化。
　　

5、結果：腎臟普通病理結果顯示糖尿病腎病患者腎小球系膜基質中重度增生，結節(jié)狀硬化，基底膜彌漫性或節(jié)段性增厚僵硬，腎小管萎縮并代償性擴張，腎間質可見多灶性纖維化；對照組患者可見系膜細胞及基質輕度增生，基底膜不厚，輕度的腎小管上皮細胞顆粒樣變性及空泡變性，腎間質和腎血管未見明顯異常。糖尿病腎病患者腎小管間質損傷指數(shù)及膠原沉積面積明顯高于對照組。免疫組化顯示：對照組患者腎小管上皮細胞有明顯的SARA表達，在腎小球系膜細胞也有一定量的表達；而糖尿病

6、腎病患者SARA表達明顯下調，尤其在腎小管上皮細胞萎縮及發(fā)生腎間質纖維化的區(qū)域。
　　 結論：糖尿病腎病患者腎組織(特別是腎小管)SARA表達下降；SARA表達下降的同時伴有腎小管間質損傷和膠原沉積，提示SARA可能與糖尿病腎病腎間質纖維化有關。
　　 目的：闡明SARA在高葡萄糖誘導的HK-2細胞EMT及ECM沉積中的作用，探討以SARA為靶點抑制高葡萄糖誘導的HK-2細胞EMT及ECM沉積的策略。
　　 方法

7、：用高葡萄糖(30mM D-葡萄糖)刺激HK-2細胞，通過細胞免疫熒光、Western blot及Realtime PCR檢測波形蛋白(Vimentin)、緊密連接蛋白(Zona occludens-1，ZO-1)及SARA的表達，通過Western blot及Realtime PCR檢測纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)和Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)的表達；轉染全長SARA質粒(SARA(WT))及敲除SBD結構

8、域的SARA質粒(SARA(dSBD))，再予高糖刺激，檢測HK-2細胞Vimentin、ZO-1、FN、ColⅠ的表達變化。
　　 結果：30mM D-葡萄糖刺激后，HK-2細胞ZO-1蛋白及其mRNA表達呈時間依賴性降低，Vimentin、FN和ColⅠ蛋白及其mRNA表達呈時間依賴性升高，而SARA蛋白及其mRNA表達呈時間依賴性下降。與高糖刺激組相比，過表達SARA使HK-2細胞ZO-1表達上調，Vimentin、FN和

9、ColⅠ表達下調；但轉染SARA dSBD質粒對高糖誘導的HK-2細胞ZO-1、Vimentin、FN和ColⅠ表達無明顯影響。
　　 結論：高糖誘導HK-2細胞轉分化及ECM沉積；高糖誘導HK-2細胞SARA表達下調；過表達SARA可逆轉HK-2細胞轉分化，抑制ECM生成，這一效應依賴于SARA的SBD結構域。
　　 目的：闡明SARA調控高葡萄糖誘導的。腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積的分子機制。
　　 方法

10、：用高葡萄糖(30mM D-葡萄糖)刺激HK-2細胞，Westernblot及Realtime PCR檢測TGF-β1、Smad2、Smad3表達，Western blot檢測p-Smad2、p-Smad3的表達水平；轉染全長SARA質粒及SARA(dSBD)質粒，再予高糖刺激，檢測Smad2、Smad3、p-Smad2、P-Smad3的表達變化。
　　 結果：高糖可誘導TGF-β1、Smad3蛋白及其mRNA表達呈時間依賴性上

11、調；Smad2 mRNA表達呈時間依賴性上調，而其蛋白表達呈時間依賴性下調；高糖可促進Smad2和Smad3磷酸化，但Smad3的活化時間更長。過表達SARA可上調Smad2的蛋白表達，但對其mRNA表達水平無明顯影響，過表達SARA對Smad3的蛋白及其mRNA表達無明顯影響；轉染SARA(dSBD)質粒對Smad2、Smad3的表達無明顯影響。過表達SARA可延長Smad2活化時間，而Smad3的活化時間相對縮短，從而改變Smad2