血管緊張素Ⅱ誘導人臍靜脈內皮細胞和人臍動脈平滑肌細胞整合素β-,3-表達的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是嚴重威協人類健康的常見病和多發(fā)病。目前關于As的研究多集中于血管內皮細胞，認為血管內皮細胞功能不良(endotheliumdysfunction)是As發(fā)生的起始和關鍵環(huán)節(jié)。黏附分子表達增高是內皮細胞功能不良的特征之一，導致單核細胞、白細胞、血小板與內皮細胞的黏附異常增強，啟動As的發(fā)生發(fā)展。 血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(reni

2、n-angiotensinsystem，RAS)主要的效應肽。它在高血壓發(fā)病機制中的作用比較明確。越來越多的研究結果發(fā)現，AngⅡ也是As的危險因素。因此，研究AngⅡ對血管內皮細胞和血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)基因轉錄的影響有助于闡明高血壓和As共同的發(fā)病機制。 整合素(integrin)是介導細胞與細胞、細胞與胞外基質相互作用的一類黏附分子。整合素族在As中的作用日益受到重

3、視。αvβ3屬于β3類整合素族，無論是內皮細胞表達的αVβ3分子還是VSMCs表達的αvβ3分子，在As的發(fā)生發(fā)展中都起著重要的作用。內皮細胞表面的αvβ3是介導血小板與內皮細胞黏附的重要分子。VSMCs表面的αvβ3是介導VSMC向內膜遷移的重要分子。已知整合素β3(integrinbeta3，Intb3)基因的轉錄量決定了細胞表面αvβ3的分子數，而致病因素如何調控Intb3基因的轉錄，目前尚未見到在人類細胞上的研究成果。

4、本室前期的工作曾觀察到人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVECs)表面αvβ3表達上調介導了高糖、高胰島素、高胰島素原、腫瘤壞死因子作用下血小板與內皮細胞的黏附，并且從蛋白水平、mRNA水平證實了AngⅡ促進內皮細胞表面Intb3的表達。本研究工作首先用RT-PCR方法重復了AngⅡ誘導HUVECsIntb3表達。根據已知的研究結果，AngⅡ致As的主要機制之一是通過增強血管壁還原

5、型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reducedformofnicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,NADPH，還原型輔酶Ⅱ)的活性，促進氧應激。為了了解AngⅡ誘導HUVECs上Intb3表達的作用是否有氧應激的參與，本研究工作用RT-PCR方法觀察了兩種抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)和維生素E(VitaminE，VE)對AngⅡ誘導作用的影響。同時構建了In

6、tb3基因5’上游調控區(qū)不同長度熒光素酶報告基因質粒，利用瞬時轉染技術導入HUVECs，觀察5’上游序列在AngⅡ對內皮細胞表面Intb3基因轉錄中的調控作用。 β-雌二醇和α-玉米赤霉醇(α-zearalanol，α-ZAL)能直接作用于內皮細胞，調節(jié)黏附分子的表達。β-雌二醇和α-ZAL能否調節(jié)HUVECs上Intb3基因的表達?本項研究用RT-PCR方法觀察了不同濃度的β-雌二醇和α-ZAL對AngⅡ誘導內皮細胞表面Int

7、b3基因轉錄的影響。并且用一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOsynthase，NOS)阻斷劑和雌激素受體阻斷劑，觀察了對β-雌二醇和α-ZAL效應的干擾作用。本項研究還觀察了β-雌二醇和α-ZAL對AngⅡ誘導的帶有NF-κB結合位點的熒光素酶報告基因質粒表達的影響，以及雌激素受體阻斷劑的作用。 VSMCs的遷移是As重要的發(fā)病機制之一。AngⅡ能夠促進VSMCs的遷移。然而，AngⅡ能否激活VSMCsI

8、ntb3轉錄，進而引起VSMC的遷移，目前國內外未見相關報道。為此，本項研究采用競爭性RT-PCR方法觀察了不同時間和不同劑量的AngⅡ對人臍動脈平滑肌細胞(humanumbilicalarterysmoothmusclecells，HUASMCs)表面Intb3基因表達的影響。 通過上述實驗取得如下結果：1.10-6MAngⅡ作用4小時HUVECsIntb3mRNA的表達量是對照組的250.13％(p＜0.001)。氧自由基清

9、除劑NAC可完全抑制AngⅡ的作用(p＜0.01)。AngⅡ分別誘導熒光素酶報告基因質粒PGL3-Intb3-1483/+125、PGL3-Intb3-900/+125、PGL3-Intb3-327/+125和PGL3-Intb3-74/+104的熒光素酶活性分別是對照組的175.47％、115.57％、95.28％和95.45％。抗氧化劑NAC完全抑制了AngⅡ誘導PGL3-Intb3-1483/+125報告基因質粒的熒光素酶活性(p

10、＜0.05)。 2.AngⅡ誘導HUVECs帶有NF-κB結合序列質粒熒光素酶活性是對照組的156.47％(p＜0.05)。IKKα-KM、IKKβ-KM和NIK-KM組完全抑制了該質粒熒光素酶的表達(p＜0.01)。 3.AngⅡ誘導HUVECsPGL3-Intb3-1483/+125質粒熒光素酶活性是對照組的176.31％(p＜0.05)。IKKα-KM、IKKβ-KM和NIK-KM組完全抑制了該質粒熒光素酶表達(p

11、＜0.01)。 4.10-6M、10-7M、10-8Mβ-雌二醇作用于HUVECs，分別抑制AngⅡ作用的95％、63％和56％。10-6M、10-7M、10-8Mα-ZAL作用于HUVECs，分別抑制AngⅡ作用的143％(p＜0.05)、107％(p＜0.05)和80％。在上述濃度，α-ZAL的作用平均強于β-雌二醇1.54倍。NOS抑制劑和雌激素受體抑制劑不能阻斷上述抑制作用。 5.10-6Mβ-雌二醇和α-ZAL

12、可完全抑制AngⅡ誘導的HUVECs含NF-κB位點質粒熒光素酶的表達(β-雌二醇，p＜0.05；α-ZAL，p＜0.01)。ICI處理組對該抑制作用無明顯影響。 6.2×10-10M、2×10-9M、2×10-8M、2×10-7M、2×10-6MAngⅡ誘導HUASMCsIntb3mRNA表達分別是對照組的102.72％、114.47％、116.65％、119.88％(p＜0.05)和122.01％(p＜0.05)。2×10-

13、8MAngⅡ分別作用0.5小時、2小時、6小時、12小時、18小時、24小時的誘導作用分別是對照組的107.94％、116.95％、125.10％、144.42％、158.36％和168.45％。 綜上所述，本研究工作進一步印證了我室以往關于AngⅡ調控HUVECsIntb3基因表達的結果。成功構建了四個含Intb3基因不同長度的啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因質粒，并在此基礎上首次發(fā)現AngⅡ誘導HUVECsIntb3表達上調的機制