脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向神經(jīng)元誘導(dǎo)過程中肌動蛋白的表達(dá).pdf

1、背景與目的： 干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)個體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細(xì)胞又可分為胚胎干細(xì)胞(embryonicstem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞(adult stem cells，ASCs)。胚胎干細(xì)胞是一種高度未分化細(xì)胞，具有發(fā)育的全能性和巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植治療方面的運(yùn)用已經(jīng)獲得了一定的療效，但圍繞該研究的倫理道德問題也隨之出現(xiàn)，嚴(yán)重阻礙了其發(fā)展及應(yīng)用。神經(jīng)

2、干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，其發(fā)現(xiàn)開辟了神經(jīng)修復(fù)的新紀(jì)元。但是，人類神經(jīng)干細(xì)胞主要來源于流產(chǎn)胚胎，其有限的來源及倫理學(xué)爭議也使其應(yīng)用受到了很大的限制。因此，尋找新的干細(xì)胞來源，具有重要的意義。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有高度自我更新的能力及多向分化的潛能。適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下，間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為多種中胚層組織的能力，甚至還具有跨胚層分化為神經(jīng)外胚層組織的

3、潛能，且其倫理問題大為減少，是細(xì)胞移植和組織工程的新型種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是骨髓MSCs必須通過侵入的途經(jīng)獲得，臍血、羊膜等組織所得到的細(xì)胞數(shù)量十份有限。所以，尋找更易獲得、含量豐富且易于培養(yǎng)的MSCs新來源，對MSCs的試驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用，具有重要意義。脂肪組織來源豐富并且易于獲得，脂肪組織中干細(xì)胞含量遠(yuǎn)高于骨髓中干細(xì)胞的含量，脂肪干細(xì)胞可以作為人干細(xì)胞庫的重要來源，是理想的組織工程種子細(xì)胞，有重要的研究和應(yīng)用價值。本研究

4、通過對SD大鼠腹股溝脂肪組織中MSCs的分離、培養(yǎng)，體外誘導(dǎo)分化，生物學(xué)特性觀察，以探討脂肪來源的MSCs在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)的方法以及在分化為神經(jīng)元細(xì)胞的過程中肌動蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究和應(yīng)用脂肪組織來源干細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 方法： 細(xì)胞培養(yǎng)： 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔過量麻醉處死，無菌條件下取出腹股溝處脂肪組織，用加入雙抗的PBS緩沖液(PBS緩沖液/100 U/L的青霉素/ 100 m

5、g/mL的鏈霉素)反復(fù)沖洗，而后眼科剪于安培瓶中充分剪碎脂肪組織，加入0/1﹪的Ⅰ型膠原酶于37℃振蕩箱內(nèi)消化60min，加入PBS緩沖液稀釋，篩網(wǎng)過濾，1200 g離心10 min，去上清，加入低糖DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中加有10﹪的FBS，2mmol/L的L-谷氨酰胺)重懸細(xì)胞，并移入50ml一次性塑料培養(yǎng)瓶中，37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中孵育，72 h后換培養(yǎng)液(培養(yǎng)液為低糖DMEM/10﹪的FBS/2mmol/L的L-谷氨酰胺)，

6、去除未貼壁的懸浮細(xì)胞。隨后每2～3天換液，約1周后細(xì)胞達(dá)80﹪～90﹪融合時，0.25﹪胰蛋白酶消化，傳代。 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)及免疫組化： 第5代的脂肪MSCs達(dá)80﹪～90﹪融合時，低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻后以微量可調(diào)移液器等量種植于細(xì)胞培養(yǎng)板中(各個細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)放置經(jīng)L-多聚賴氨酸包被的消毒蓋玻片)。待細(xì)胞達(dá)到60-70﹪左右融合時，加入預(yù)誘導(dǎo)劑〔低糖 DMEM 培養(yǎng)基/10﹪FBS/ 10ug/ml堿性成

7、纖維細(xì)胞生長因子(basic FibroblastGrowth Factor，bFGF) 〕，培養(yǎng)24小時觀察細(xì)胞形態(tài)。取其中一細(xì)胞爬片進(jìn)行神經(jīng)巢蛋白(nestin)免疫熒光染色，其余更換為誘導(dǎo)劑〔低糖DMEM培養(yǎng)基/2﹪，5﹪，10﹪二甲基亞砜(DMSO)/6mmol/Lb-巰基乙醇(BME) 〕誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3小時、5小時、7小時后分別取出細(xì)胞爬片終止生長，進(jìn)行肌動蛋白(ACTIN)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)

8、巢蛋白(nestin)免疫熒光染色。 結(jié)果： 接種后24h內(nèi)，經(jīng)工型膠原酶消化從腹股溝脂肪組織中分離的體積較大的細(xì)胞多數(shù)已貼壁并開始伸展；大部分呈梭行，也有的呈圓型或多角形。72小時左右在相差顯微鏡中已可觀察到開始分裂增值的細(xì)胞，形狀呈較規(guī)則的梭型，有粗大突起伸出，核居中，有的可看到1-2個核仁。一周后，顯微鏡下可見大量的成纖維樣細(xì)胞成單層生長并且排列具有一定的方向性。細(xì)胞接種時，培養(yǎng)物中混有大量的紅細(xì)胞，隨培養(yǎng)時間的延

9、長，這些紅細(xì)胞隨換液次數(shù)的增多而被清除。約1周后細(xì)胞達(dá)80﹪～90﹪融合時以1∶3傳代，傳代后第一天，即可見細(xì)胞呈梭樣改變，第3-4天鋪滿瓶壁。傳至三代后，細(xì)胞形態(tài)均勻，呈長梭樣；培養(yǎng)五代后，細(xì)胞仍呈長梭樣，并且增生活躍。體外培養(yǎng)8-10代后，細(xì)胞的增值速度明顯減慢，細(xì)胞較前寬大，甚至不再增值。經(jīng)低糖DMEM培養(yǎng)基/10﹪FBS/10ug/ml bFGF預(yù)誘導(dǎo)，可見相當(dāng)一部分細(xì)胞成nestin免疫熒光染色陽性，提示有神經(jīng)前體細(xì)胞生成。誘

10、導(dǎo)24h后更換為DMEM培養(yǎng)基/2﹪，5﹪，10﹪DMSO/6mmol/LBME誘導(dǎo)，3小時、5小時、7小時nestin陽性細(xì)胞逐漸減少，而NSE陽性的神經(jīng)元樣細(xì)胞則大量增加。 誘導(dǎo)3小時、5小時、7小時后進(jìn)行肌動蛋白(ACTIN)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見脂肪MSCs定向分化為神經(jīng)元的過程中，分化3h后，細(xì)胞體積較小，突起較短，陽性反應(yīng)物分布于細(xì)胞核及胞質(zhì)中，分化5、7h后，隨著細(xì)胞的生長，ACTIN蛋白在胞漿及突起均呈陽性表達(dá)，

11、并隨著突起的伸展而不斷延伸，且可見突起內(nèi)有陽性表達(dá)物直達(dá)突起末端。證明肌動蛋白的表達(dá)對定向分化的神經(jīng)元的生長和發(fā)育起著重要作用。 結(jié)論： 1．用Ⅰ型膠原酶成功地從Sprague-Dawley大鼠腹股溝處脂肪組織中分離和培養(yǎng)了MSCs，脂肪MSCs可以在含10﹪的FBS和2mmol/L的L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行體外增殖。 2．脂肪MSCs經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)后可有神經(jīng)前體細(xì)胞的生成，這些細(xì)胞今后可能分化為