豬T細胞表面分子CD3ε單克隆抗體的制備.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、CD3是豬T細胞的重要表面分子，由γ、δ、ε、η、ζ五種多肽鏈組成。本研究采用RT-PCR方法從豬外周血淋巴細胞總RNA中擴增出CD3ε基因，成功構建了表達豬CD3ε的和穩(wěn)定表達細胞系；以原核表達的CD3ε重組蛋白作為免疫原，利用重組腺病毒和穩(wěn)定表達細胞系篩選到5株分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，為豬傳染病的免疫評價和致病機理研究奠定了物質基礎。 利用巢式PCR方法從豬外周血淋巴細胞總RNA中擴增出包括CD3ε全長基因的641bp

2、基因片段并插入腺病毒穿梭載體構建出穿梭質粒pDC316-CD3ε，與腺病毒輔助質粒共轉染293細胞后獲得重組腺病毒Adv-CD3ε。該重組腺病毒可在293細胞中穩(wěn)定傳代，Adv-CD3ε感染的BHK-21細胞可被CD3ε抗體所識別。將擴增出的CD3ε基因片段插入真核表達載體構建出真核表達質粒pcDNA3.1-CD3ε，轉染BHK-21細胞后用G418進行加壓篩選得到穩(wěn)定表達豬CD3ε的BHK-21細胞，經(jīng)克隆擴大培養(yǎng)后得到穩(wěn)定表達并可被

3、CD3ε抗體所識別的細胞系。 利用原核表達的CD3ε重組蛋白免疫8周齡Balb/c小鼠，取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合。用基于CD3ε重組蛋白的間接ELISA和構建的重組腺病毒與穩(wěn)定細胞系進行間接免疫熒光試驗篩選陽性孔。采用有限稀釋法對剛性孔進行3次克隆，最終獲得5株穩(wěn)定分泌抗豬CD3ε的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，分別命名為AB、BF、CA、DG、GF。間接ELISA檢測單抗腹水效價，結果表明AB、DG、GF的效價達1:8

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