陽離子聚合物β-CD-PAMAM作為基因載體的評估.pdf

1、糖尿病患者皮膚易損，且一旦出現(xiàn)傷口很難愈合。其原因主要包括：(1)患者全身因素(如代謝營養(yǎng)狀況、免疫力等)；(2)傷口局部因素(如是否合并感染、周圍組織的血管病變、神經病變等)；(3)傷口微觀的改變(過量的基質金屬蛋白酶分泌、生長因子缺乏、組織增殖能力降低、微循環(huán)的異常、炎癥因子分泌過多等)。這些原因最終導致細胞外基質合成和降解的失平衡，從而影響潰瘍愈合。
　　 基質金屬蛋白酶9(MMP-9)是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族中的

2、一員，又稱明膠酶B，是依賴Zn2+的金屬酶。在糖尿病病理狀態(tài)下：(1)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病病人的足潰瘍滲出液中基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的水平較正常人升高。(2)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠皮膚MMP-9的水平較正常大鼠明顯增高，MMP-9/TIMP-1(組織金屬蛋白酶抑制劑-1)之間平衡失調，細胞外基質過度降解，可能與糖尿病大鼠傷口愈合減慢有關。(3)在糖尿病足患者中，單純局部應用生長因子并不能加快潰瘍愈合，考慮可能與MMP-9的升高

3、加速降解生長因子、生長因子受體、整合素及其受體，從而加重傷口局部炎癥反應，減慢傷口愈合。因此抑制傷口局部MMP-9的表達是促進糖尿病足傷口愈合的可選擇方法之一。然而目前還沒有特異性MMP-9抑制劑，且MMPs抑制劑(TIMP)價格十分昂貴，不適合臨床常規(guī)使用，所以，通過RNA干擾技術抑制糖尿病傷口MMP-9的表達成為可供選擇的方法之一。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)近年來發(fā)展迅速，已經從基礎研究

4、發(fā)展到臨床應用。RNA干擾技術的核心是通過內源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內mRNA發(fā)生特異性降解，導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能表型缺失，這種依賴于dsRNA的轉錄后基因沉默過程被稱為RNA干擾。此技術的關鍵步驟之一就是將基因轉導進入細胞的技術。
　　 基因的轉導需要高效率、高安全性的載體，由于病毒載體潛在的安全性問題，很大程度限制了其在體內實驗中的應用，故人們一直致力尋找新的基因轉導載體。非病毒載體中的

5、新型陽離子聚合物目前受到極大關注，因為其具有以下優(yōu)點：(1)無免疫原性，不會引起機體的免疫反應；(2)通過控制粒徑尺寸和表面性質可控制載體的生理行為；(3)可根據需要設計載體的分子結構；(4)遺傳物質的釋放可做到由聚合物基質的降解速率決定。陽離子聚合物與核酸帶負電的磷酸基團通過靜電相互作用形成復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內吞作用進入細胞。中山大學化學與化學工程學院高分子研究所張黎明教授課題組通過分子設計合成星型陽離

6、子聚合物β-CD-PAMAM，該聚合物具有以下優(yōu)點：(1)具有良好的水溶性和生物相容性；(2)可與siRNA形成納米粒；(3)表面大量的陽離子基團，提供了進一步功能化的可能。但該聚合物生物安全性、對siRNA的結合和轉導能力如何還不明確。β-CD-PAMAM的化學結構如下：
　　 研究目的:
　　 1.了解β-CD-PAMAM的細胞毒性。
　　 2.探討β-CD-PAMAM與MMP-9特異性siRNA的結合能力。

7、
　　 3.β-CD-PAMAM介導FAM標記的siRNA轉染效率評估。
　　 4.β-CD-PAMAM介導的RNAi對大鼠皮膚成纖維細胞CRL1213MMP-9抑制效果評估。
　　 材料與方法:
　　 所用細胞為大鼠皮膚成纖維細胞株CRL1213(編號4032860)，購自美國組織培養(yǎng)庫(ATCC)。
　　 1.β-CD-PAMAM的細胞毒性實驗(MTT法)
　　 將大鼠皮膚成纖維細胞株

8、CRL1213分為正糖培養(yǎng)組(5.6mmol/L)和高糖培養(yǎng)組(25mmol/L)，每種糖濃度組再根據β-CD-PAMAM的終濃度分為21.3ug/ml、16.0ug/ml、10.7ug/ml、5.3ug/ml、2.1ug/ml及空白對照組，每組設五個復孔，加入β-CD-PAMAM后24h、48h、72h測各組在492nm的OD值。細胞活力(％)=[A492(實驗組)/A492(對照組)]×100，實驗重復三次結果取平均值。
　　

9、 2.瓊脂糖凝膠電泳檢測新型陽離子聚合物β-CD-PAMAM與siRNA結合能力β-CD-PAMAM與MMP-9特異性siRNA按照質量比40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1混合后行瓊脂糖凝膠電泳，帶正電荷的聚合物與帶負電的siRNA會通過電荷作用互相結合，若陽離子聚合物的量足夠，會與siRNA充分結合，則瓊脂糖凝膠電泳顯示siRNA被阻滯在上樣孔內，或向負極泳動。
　　 3.β-CD-PAMAM介導FAM標記的si

10、RNA轉染效率評估
　　 將大鼠皮膚成纖維細胞株CRL1213分為正糖培養(yǎng)組(5.6mmol/L)和高糖培養(yǎng)組(25mmol/L)，在每種糖濃度下，β-CD-PAMAM與siRNA按照質量比分為40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1組，同時設Lipofectamine2000與siRNA混合組。轉染后24小時內通過激光共聚焦顯微鏡觀察轉染效果，流式細胞儀檢測轉染效率及細胞死亡數(shù)，篩選出轉染效率最優(yōu)體系。實驗重復三次結果取

11、平均值。
　　 4.β-CD-PAMAM介導的RNAi對大鼠皮膚成纖維細胞CRL1213MMP-9抑制效果評估
　　 將大鼠皮膚成纖維細胞株CRL1213分為正糖培養(yǎng)組(5.6mmol/L)和高糖培養(yǎng)組(25mmol/L)，行qRT-PCR檢測MMP-9表達。高糖+脂多糖(LPS)1ug/ml18小時刺激建立MMP-9高表達細胞模型后再次行qRT-PCR檢測MMP-9表達。然后將篩選出的β-CD-PAMAM介導的轉染效率

12、最優(yōu)體系和Lipofectamine2000介導的轉染體系轉染細胞，24小時后行qRT-PCR檢測MMP-9表達。評價β-CD-PAMAM介導的RNAi對大鼠皮膚成纖維細胞CRL1213MMP-9抑制效果。實驗重復三次結果取平均值。
　　 5.統(tǒng)計學分析
　　 實驗數(shù)據采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較用Bonferroni法