復合型組織工程化自體皮膚體外快速構建的實驗研究.pdf

1、本文研究目的：尋找一種體外快速構建復合型組織工程化自體皮膚的可行方法，為大面積燒創(chuàng)傷創(chuàng)面的覆蓋快速提供足夠的自體皮膚。 研究方法：含表皮干細胞的表皮細胞群的分離(三種分離方法的比較)：分別應用Ⅰ型膠原酶法、胰蛋白酶法及中性蛋白酶法，進行人皮膚組織表皮細胞群的分離。前者分離所得的表皮層及后兩者分離表皮層后的真皮層，均進行組織學切片，蘇木素-伊紅(H-E)染色觀察，三者所得表皮細胞群均經流式細胞儀檢測其中角蛋白19(K19)陽性細胞

2、的百分比。含表皮干細胞的表皮細胞群的鑒定及培養(yǎng)：Ⅰ型膠原酶法分離的表皮細胞群，分別進行K19-異硫氰酸熒光素(FITC)及β1-整合素(integrin)-氰3(Cy3)免疫熒光鑒定，克隆形成率試驗，并對比培養(yǎng)基添加角質細胞生長因子(KGF)與否對表皮細胞群生長曲線的影響，應用絲裂霉素-C處理后的人成纖維細胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)表皮細胞群，觀察其體外增殖情況。成纖維細胞的分離培養(yǎng)及鑒定：Ⅰ型膠原酶法分離表皮細胞時的消化剩液經過濾離心后，所得細胞進

3、行體外擴增培養(yǎng)，光鏡下觀察形態(tài)，并行波形蛋白(vimentin)-FITC免疫熒光鑒定。復合型組織工程化自體皮膚的構建：表皮細胞群以1×105個/cm2直接接種于脫細胞真皮基質(ADM)的乳頭面，約第7天時，翻轉ADM再接種已擴增的成纖維細胞，收集標本進行組織學切片H-E染色，表皮層細胞計數(shù)，設培養(yǎng)基添加KGF組及不添加組。構建皮膚修復裸鼠全層皮膚缺損的初步實驗：構建皮膚移植于裸鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面，設三組對照，對照一：裸鼠自體全厚皮

4、片移植(將背部一側取下皮膚移植于另一側)，對照二：單純ADM移植，對照三：裸露創(chuàng)面不做修復。修復后約6周，收集實驗組創(chuàng)區(qū)皮膚，進行組織學切片H-E染色，抗人角蛋白10(K10)-FITC及K19-FITC免疫熒光檢測。 研究結果：Ⅰ型膠原酶法分離所得的表皮細胞群中K19陽性表達的細胞最高可接近17％，比胰蛋白酶法及中性蛋白酶法高。表皮細胞群中，K19-FITC及β1-integrin-Cy3免疫熒光鑒定顯示有K19陽性及β1-i

5、ntegrin較高表達的細胞，其克隆形成率介于1％-8％之間；表皮細胞單純體外培養(yǎng)困難，添加KGF后，增殖較快，且分化有所減緩，但仍漸分化成復層，并脫落；人成纖維細胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)的表皮細胞群，于約第3天時開始出現(xiàn)克隆樣增殖，并漸出現(xiàn)復層化，經幾次換液后，復層化細胞脫落，殘留細胞開始呈現(xiàn)單層克隆樣增殖，于約14天時漸推開成纖維細胞，形成融合，但仍無法維持繼續(xù)傳代。Ⅰ型膠原酶法分離表皮細胞時，可同期獲得成纖維細胞，體外培養(yǎng)擴增較容易，約7天左

6、右即可擴增100倍，vimentin-FITC免疫熒光染色呈陽性染色。利用先期接種表皮細胞于ADM，再接種已擴增的成纖維細胞，并應用添加KGF的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以快速構建出超過30倍于原取材面積的皮膚，表皮層連續(xù)，細胞層數(shù)多為2-3層，部分分層較好，表皮層與真皮層之間的粘著均不緊密，真皮中含有成纖維細胞；表皮層細胞計數(shù)顯示，KGF添加組細胞計數(shù)明顯高于未添加組。所構建皮膚能夠較好的修復皮膚缺損創(chuàng)面，創(chuàng)區(qū)皮膚表皮層分層好，均有3-4層細

7、胞覆蓋，真皮層膠原排列有序，成纖維細胞分布均勻，未見皮膚附屬器，與裸鼠自體全厚皮片移植修復后的皮膚組織結構基本接近；抗人K10-FITC免疫熒光顯示創(chuàng)區(qū)表皮層，絕大部分細胞呈綠色的陽性染色，抗人K19-FITC免疫熒光顯示僅有極個別基底層細胞呈綠色的陽性染色。 研究結論：利用膠原酶消化法，以及添加KGF的條件培養(yǎng)基，采用分步接種法，可以在體外短期內(約8天)構建出足夠可用(約30倍于取材面積)的復合型組織工程化自體皮膚，這可能為