MCPIP1對(duì)SMC表型的調(diào)節(jié)及其與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性研究.pdf

1、第一章:MCPIP1在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈的表達(dá)及細(xì)胞定位
　　目的:單核細(xì)胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一類CCCH型鋅指家族分子。大量研究表明其在炎癥反應(yīng)、免疫穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞分化、自噬和凋亡等諸多方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，但目前對(duì)MCPIP1與動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系尚不十分了解。因此本研究的主要目的是觀察MCPIP1在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈的表達(dá)水平及細(xì)胞定位。
　　方法:采用高膽固醇飲

2、食喂養(yǎng)8周齡apoE-/-小鼠，建立小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):(1)檢測(cè)小鼠血清血脂水平;(2)通過大體觀、蘇丹Ⅲ和HE染色，觀察小鼠主動(dòng)脈斑塊形成情況;(3)通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清MCP1水平;(4)采用Western Blot檢測(cè)小鼠胸主動(dòng)脈MCPIP1蛋白表達(dá);(5)通過激光共聚焦顯微鏡觀察MCPIP1在小鼠胸主動(dòng)脈的細(xì)胞定位。
　　結(jié)果:血清血脂水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠相比，高

3、脂喂養(yǎng)apoE-/-小鼠血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平明顯較高(P＜0.05)，而高密度脂蛋白(HDL-C)水平明顯較低(P＜0.05)。通過大體觀、蘇丹Ⅲ和HE染色發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠相比，高脂喂養(yǎng)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊面積明顯較大，有顯著性差異(P＜0.05);酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠相比，高脂喂養(yǎng)apoE-/-小鼠血清MCP1水平明顯較高，有顯著性差異(

4、P＜0.05); Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠相比，高脂喂養(yǎng)apoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈MCPIP1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，有顯著性差異(P＜0.05);免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有MCPIP1表達(dá)，但是其在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)更為顯著。
　　結(jié)論:C57BL/6小鼠和動(dòng)脈粥樣硬化小鼠胸主動(dòng)脈均表達(dá)MCPIP1蛋白，但動(dòng)脈粥樣硬化小鼠胸主動(dòng)脈MCPIP1的蛋白表達(dá)較同齡野生小鼠顯著下降。

5、小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有MCPIP1表達(dá)，但是其主要定位于動(dòng)脈壁的平滑肌細(xì)胞中。
　　第二章: MCPIP1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)的影響及機(jī)制探討
　　目的:我們前期在體研究已證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠胸主動(dòng)MCPIP1蛋白表達(dá)較同齡野生小鼠顯著下降，且小鼠主動(dòng)脈的MCPIP1主要定位于血管平滑肌細(xì)胞。目前認(rèn)為體外培養(yǎng)的VSMC主要表現(xiàn)為分化程度較低的合成型VSMC，我們初步研究發(fā)現(xiàn)其僅表達(dá)極少量的MCPIP

6、1蛋白。已知血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，由此，我們推測(cè)MCPIP1可能通過調(diào)節(jié)VSMC表型，影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。因此本研究的主要目的為體外觀察MCPIP1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制。
　　方法:利用免疫熒光對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用不同濃度的MCP1(0、50、100 ng/ml)干預(yù)人和大鼠平滑肌細(xì)胞24小時(shí)后，用Western Blot和Real ti

7、me qPCR分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MCPIP1、myocardin及其下游靶基因SM-α-actin、SM22蛋白及mRNA的表達(dá)水平。用攜帶MCPIP1的重組腺病毒轉(zhuǎn)染hSMCs48h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MCPIP1、myocardin及其下游靶分子SM-α-actin、SM22的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:使用不同濃度MCP1刺激人和大鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(0 ng/ml MCP1)相比，100 ng/ml MCP1處理顯著誘導(dǎo)人和

8、大鼠血管平滑肌細(xì)胞MCPIP1的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。與對(duì)照組（0 ng/ml MCP1）相比，100 ng/ml MCP1處理顯著誘導(dǎo)人和大鼠血管平滑肌細(xì)胞SM-α-actin、SM22、myocardin的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。采用攜帶MCPIP1的重組腺病毒轉(zhuǎn)染hSMCs48h發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和Ad-GFP(空載病毒載體)組相比，Ad-MCPIP1組MCPIP1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。此外，Ad-MCPIP1組SM-α-actin

9、、SM22和myocardin蛋白的表達(dá)也顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:MCPIP1可促進(jìn)VSMC收縮表型標(biāo)志物SM-α-actin、SM22的表達(dá)上調(diào)。此外，MCPIP1可誘導(dǎo)myocardin表達(dá)上調(diào)，后者可能參與介導(dǎo)MCPIP1對(duì)VSMC表型的調(diào)節(jié)。
　　第三章:MCP1對(duì)組織培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈收縮功能的影響及相關(guān)機(jī)制探討
　　目的:我們前期體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MCP1處理的血管平滑肌細(xì)胞MCPIP1表達(dá)明顯上調(diào)，并伴有V

10、SMC收縮表型標(biāo)志物SM-α-actin、SM22的表達(dá)上調(diào)，提示MCPIP1可參與VSMC表型分化的調(diào)節(jié)。因此，本研究擬進(jìn)一步通過離體組織培養(yǎng)，觀察MCP1處理對(duì)組織培養(yǎng)血管收縮功能的影響，并初步探討MCPIP1是否參與組織培養(yǎng)時(shí)血管平滑肌細(xì)胞去分化過程。
　　方法:獲取大鼠胸主動(dòng)脈，等分為長約2mm血管環(huán)，分為三組:(1)新鮮血管組;(2)無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育72h;(3)含MCP1(100ng/ml)的無血清DMEM培

11、養(yǎng)基中孵育72h。然后將樣本用于以下實(shí)驗(yàn):(1)用myograph技術(shù)檢測(cè)血管環(huán)對(duì)KC1和PE的收縮反應(yīng);(2)用Western Blot檢測(cè)血管環(huán)MCPIP1、myocardin及其下游靶分子SM-α-actin、SM22蛋白的表達(dá);(3)用real time qPCR檢測(cè)血管環(huán)MCPIP1、myocardin及其下游靶基因SM-α-actin、SM22 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:Myograph技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與新鮮血管環(huán)相比

12、，組織培養(yǎng)72小時(shí)的血管環(huán)對(duì)KC1和PE的收縮反應(yīng)顯著下降，而MCP1處理可部分逆轉(zhuǎn)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的血管收縮功能下降。Western Blot和real time qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與新鮮血管環(huán)相比，組織培養(yǎng)72小時(shí)的血管環(huán)MCPIP1蛋白和mRNA的表達(dá)均顯著下調(diào);而MCP1處理可部分逆轉(zhuǎn)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的MCPIP1蛋白和mRNA的表達(dá)下調(diào)。與新鮮血管環(huán)相比，組織培養(yǎng)72小時(shí)的血管環(huán)SM-α-actin、SM22、myocardin蛋白和m