miR-126靶向PIK3R2調(diào)控內(nèi)皮祖細胞及在靜脈血栓再通中的作用研究.pdf

1、目的:研究miR-126調(diào)控內(nèi)皮祖細胞及對靜脈血栓溶解、機化和再通的影響,為慢性深靜脈血栓的治療提供一種新的治療思路。
　　方法:首先分離、培養(yǎng)及鑒定骨髓源性內(nèi)皮祖細胞,將miR-126模擬物、抑制劑或陰性對照物用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮祖細胞中,采用MTT、流式細胞術(shù)檢測miR-126對內(nèi)皮祖細胞增殖及細胞周期的影響;采用劃痕實驗、穿膜實驗檢測miR-126對內(nèi)皮祖細胞運動遷移能力的影響;采用matrigel管腔形成實驗檢測miR-

2、126對內(nèi)皮祖細胞成小管能力的影響。進一步預(yù)測miR-126靶基因PIK3R2,并構(gòu)建包含野生型PIK3R23’UTR和突變體PIK3R23’UTR的Luciferase報告基因載體,檢測miR-126對PIK3R2的直接調(diào)控作用,Western blot分析PIK3R2蛋白以及PI3K/AKT信號通路中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的變化。再構(gòu)建miR-126慢病毒表達載體(pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126),H

3、EK293T細胞包裝、重組、擴增慢病毒顆粒,熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達, PCR、雙酶切、基因測序進行鑒定。pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞,用實時熒光定量PCR(qPCR)方法檢測轉(zhuǎn)染后的內(nèi)皮祖細胞中miR-126的表達。然后結(jié)扎大鼠腎下段下腔靜脈建立深靜脈血栓模型,將慢病毒轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細胞移植到靜脈血栓模型中。分為三組:A組(12只),空白對照組,經(jīng)尾靜脈注射1ml PBS;B組(12只),EP

4、Cs/pLVX-IRES-ZsGreen Vector(EPCs/vector),經(jīng)尾靜脈注入含有1.0×106EPCs/vector的PBS細胞懸液。C組(12只), EPCs/pLVX-IRES-ZsGreen-miR-126(EPCs/miR-126),經(jīng)尾靜脈注入含有1.0×106EPCs/miR-126的PBS細胞懸液。移植后7天、14天取出血栓段下腔靜脈及血栓,通過稱重評價血栓溶解情況,熒光示蹤觀察內(nèi)皮祖細胞歸巢到靜脈血栓情

5、況, HE染色評價靜脈血栓機化及CD34免疫組化觀察血栓再通變化。采用SPSS15.0軟件進行分析,P<0.05為差異,有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:成功培養(yǎng)、鑒定了大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞。電轉(zhuǎn)成功后,miR-126對內(nèi)皮祖細胞早期具有促進增殖及改變細胞周期的作用,后期沒有影響。劃痕實驗及穿膜實驗都證實了miR-126模擬物能夠顯著促進內(nèi)皮祖細胞的遷移運動能力;miR-126抑制劑則能抑制內(nèi)皮祖細胞的遷移運動能力。miR-126模擬物

6、可以增強內(nèi)皮祖細胞的成小管能力,miR-126抑制劑能抑制內(nèi)皮祖細胞的成小管能力。野生型PIK3R23’UTR和突變體PIK3R23’UTR的Luciferase報告基因載體構(gòu)建及鑒定成功,共轉(zhuǎn)染miR-126模擬物和pMIR/PIK3R2報告基因載體后,螢光素酶活性明顯降低,而共轉(zhuǎn)染miR-126抑制劑和pMIR/PIK3R2報告基因載體后,螢光素酶活性變化不大,共轉(zhuǎn)染miR-126模擬物或抑制劑和pMIR/PIK3R2/mut報告基

7、因載體后則不影響信號強度。上調(diào)內(nèi)皮祖細胞中miR-126表達水平后,其PIK3R2蛋白表達水平明顯下降,PI3K和磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白表達上調(diào),而下調(diào)內(nèi)皮祖細胞中miR-126表達水平后,其PIK3R2蛋白表達水平明顯增加,PI3K和磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白表達下調(diào)。經(jīng)酶切及測序結(jié)果提示慢病毒表達載體pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126構(gòu)建正確,能有效轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞,轉(zhuǎn)染 miR-126后在內(nèi)皮祖細胞

8、的表達較對照組高216倍。內(nèi)皮祖細胞被移植到靜脈血栓后,在7天和14天兩個時間段內(nèi),EPCs/miR-126組中靜脈血栓的重量最低,螢光陽性細胞數(shù)目最多,HE染色和CD34免疫組化提示更能促進血栓的機化和再通,均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:miR-126能夠促進內(nèi)皮祖細胞成血管能力,包括增殖、遷移和成小管能力,miR-126能夠負性調(diào)控其靶基因PIK3R2,激活PI3K/AKT信號通路。上調(diào)內(nèi)皮祖細胞的miR-126表達后能夠促進靜